血 - 海南ライトニングファスト株式会社

Communications Biology volume 6、記事番号: 517 (2023) この記事を引用

584 アクセス

7 オルトメトリック

メトリクスの詳細

Dermanyssus gallinae は、野鳥や養殖家禽に寄生する吸血ダニです。驚くほど迅速な血液処理と、ほとんどの発育段階で吸血する能力により、このダニは非常に衰弱性の害虫となっています。ヘモグロビンが豊富な食餌の消化に対する特異的な適応を特定するために、我々は寄生虫の飢餓期と吸血期のトランスクリプトームを構築して比較し、中腸に富む転写物を同定した。我々は、システインプロテアーゼをコードする中腸転写産物が血液粉により上方制御されることに注目した。完全なタンパク質分解装置をマッピングしたところ、カテプシン B および C のホモログが欠落している一連のシステインプロテアーゼの減少に気づきました。さらに、ダニの生殖能力を促進するビテロゲニンをコードする 3 つの異なる転写産物を同定し、系統発生学的に分析しました。また、ヘム生合成とフェリチンに基づく鉄貯蔵および組織間輸送システムの転写産物を完全にマッピングしました。さらに、免疫シグナル伝達（Toll および IMD 経路）および活性（ディフェンシンおよびチオエステル含有タンパク質）、RNAi、およびイオンチャネリング（フルララナー、フィプロニル、イベルメクチンなどの市販の殺ダニ剤の標的）に関与するタンパク質をコードする転写産物を同定しました。ウイルス配列はイルミナの読み取りからフィルタリングされ、新規ウイルスであるワクモクアランジャウイルス 1 の同定とともに D. gallinae の RNA バイロームの一部を記載しました。

ダニは吸血性の鳥類の外部寄生虫です1。家禽のワクモ (D. gallinae) は、重要かつ拡大を続ける世界市場の一部である国内および商業集約的な卵生産 2,3,4 の両方で採卵場で発生する世界的な害虫です 5。 D. gallinae ダニのライフサイクルは非常に短く、1 週間以内に幼若期から成熟した成虫段階に移行します。ほとんどの発育段階で吸血する必要があり、繁殖力が速いため、D. gallinae は非常に刺激性が高く厄介な害虫となっています。吸血中に、D. gallinae ダニは、人獣共通感染症を含むいくつかの重大な動物病原体を宿主に伝染させる可能性があります 6。多数のウイルスや細菌が D. gallinae に関連していることが発見されていますが、ベクターまたはリザーバーとして機能するその能力が実験的に裏付けられているのは、少数の病原体のみです 8、9、10。これは、卵関連サルモネラ症や家禽腸チフスの原因となるサルモネラ菌属 10 の伝播、および鳥インフルエンザ A ウイルスの蔓延 12 にとって特に憂慮すべきことです。 D. gallinae は他のいくつかの細菌種やウイルス種とも関連付けられており、その媒介能力の実験による確認が待たれています 2,10,13,14。

ダニの蔓延が採卵生産における鶏の福祉に及ぼす世界的な影響については一般的な知識があるにもかかわらず、迅速かつ反復的な吸血、血液の消化、発生、生殖を可能にする分子プロセスについての理解は依然として不足しています。以前のトランスクリプトーム研究では、D. gallinae ダニの全身のトランスクリプトームが、主に発生段階または摂食状態に特異的な方法で記述されていました 15、16、17、18。私たちの知識をさらに高めるために、血液の摂食と消化を成功させるための鍵となるタンパク質をコードする中腸特異的な転写物を特定することを目指しました。それを達成するために、我々は新たに配列決定して組み立てたトランスクリプトームを比較し、その後、明らかな腸特異的発現を有する、給餌されていないダニよりも吸血されたダニに富む転写物を選択した。宿主の血液タンパク質の酵素消化、ヘムと鉄の生物学、卵黄形成、自然免疫など、成功した吸血者に固有のプロセスに特別な注意が払われました。次に、RNA-seq データは、複数の独立した生物学的複製から調製された cDNA セットに対する RT-qPCR によって検証されました。さらに、我々は、選択された分子と経路の重要性を理解するために、エクスビボでの膜給餌または血腔への微量注入によって小分子阻害剤をダニに導入するいくつかのバイオアッセイでRNA-seqデータ解析を補完した。さらに、ウイルス起源の Illumina リードが除外され、ダニ RNA バイロームの部分的なアセンブリに使用されました。

この研究では、D. gallinae ダニの 30 個体または顕微解剖された中腸の 4 つの発生段階のトランスクリプトーム組成を、Illumina RNA-seq リードの de novo アセンブリによって調査しました (図 1a)。具体的には、我々は、無給餌の原生動物（UP、飢餓個体）と給血原生動物（FP）の全身に由来する5つのRNA-seqライブラリーを構築した。すなわち、未感染の無給餌個体と給血個体の両方が存在する唯一の発生段階であり、評価が可能である。宿主の吸血に応答した転写物調節の様子（図1b）。これらは、給餌された中腸と成体、および血液を給餌された成体から解剖された中腸によって補完されました（図1b）。各ライブラリーについて、Q30 ≥ 93.90% の Phred スコアを持つ 54 M を超えるリードが得られ、これらは 85,117 個のコンティグに組み立てられました (補足表 S1)。注釈を付けた後、細菌汚染物質が除去されました（補足表S2）。 D.ガリナエダニには有核白血球と赤血球からなる鶏の血液が与えられたため、総読み取り値の4％が鶏由来であり、そのうち（79％）は予想どおり中腸トランスクリプトームで見つかりました（補足図S1）。）。特定されたニワトリの配列はフィルタリングされ、次の分析から除外されました。合計 18,101 個の D. gallinae 特異的コンティグが、BioProject PRJNA597301 および Transcriptome Shotgun Assembly (TSA) GIFZ00000000 として NCBI サーバーに寄託されており、TSA データベースの NCBI BLAST を通じてアクセスできます。コンティグは、ハイパーリンクされた Excel シート (「データの利用可能性」を参照) にもリストされ、利用可能なコード化された予測タンパク質特性、特定のデータベースに従って組み立てられたコンティグの注釈、差次的発現統計、予測される細胞プロセスが示されます。トランスクリプトームの完全性を評価するために、プロテオームの BUSCO 分析を実行しました。その結果、完全な BUSCO の収率は 91.8% でした。 D. ガリナエ特異的コンティグから生成されたヒートマップは、未成熟段階と成体段階のトランスクリプトームの違いを明確に示し、給血されていないダニに対する吸血されたダニの転写物の量の違いも強調しました (補足図 S1)。

この研究で行われた実験ワークフローの概略図。 b 発達段階ごとに分類された代表的な個体の顕微鏡写真。

吸血に関連する転写物を同定するために、吸血と非摂食幼虫、すなわちまだ血液と接触していない発生段階から発生したUPのトランスクリプトームを比較しました（図2a）。ダニの吸血に重要なタンパク質をコードする転写物を同定するために、UP よりも血液 FP に少なくとも 16 倍豊富に含まれる転写物をフィルタリングしました。これらの転写産物は合計 906 個でした (図 2a)。これらの転写物は、中腸トランスクリプトームライブラリー内で少なくとも 1 の FPKM 値を有するものがさらに濃縮されました。このようにして、我々は、摂血関連タンパク質をコードしていると考えられる264個の転写物を同定した（図2a）。遺伝子オントロジーは、最も豊富な転写物を含む細胞外マトリックスとシグナル伝達によるシグナル伝達、発現の核制御、およびタンパク質恒常性の濃縮を示しています（図2b）。最も差次的に発現される転写物 (DET) には、分泌型メタロカルボキシペプチダーゼ (M14 プロテアーゼ)、システインプロテアーゼ (カテプシン L5 およびレグマイン 4)、セリンプロテアーゼ (スタブル)、およびキューティクルタンパク質、ムチン、ペリトロフィンなどの細胞外構造糖タンパク質があります (図 1)。 2c)。転写発現 FPKM 値を統計的に意味のある定量的比較に適したものにするために、少なくとも 4 つの生物学的複製の独立したテンプレートからのリアルタイム定量 PCR (RT-qPCR) によってトランスクリプトームを検証しました (以下を参照)。 RT-qPCR分析により、吸血制御が確認され、転写物のほとんどが吸血されていないダニと比較して吸血されたダニで有意に上方制御されていました（図2c'）。中腸特異的プロセスについてのさらなる洞察を得るために、成人の全身に対する中腸発現FPKM値の倍率変化を示す示差的に発現された中腸転写物を選択した。最も深い中腸特異的発現を示す転写物は、プロテアーゼ、フェリチン2（鉄結合タンパク質）、フェロケラターゼ（ヘム生合成の末端酵素）、および血リンパ輸送リポ糖タンパク質をコードする転写物である（図2d）。これらの DET は、独立した RT-qPCR によって再度確認されました (図 2d')。これらのデータは、D. gallinae ダニの吸血成功の鍵として、タンパク質分解消化と金属恒常性 (メタロスタシス) が重要であることを強調しています。

a ベン図は、摂食されていない原音よりも FPKM 値が 16 倍を超える摂食原音に富む転写物と、中腸における FPKM ≧ 1 の転写物との組成の重複を示しています。 b 棒グラフは、吸血によって濃縮された個々の転写物によってコードされるタンパク質のクラスを示します。転写物は、コードされたタンパク質のクラスに従って分類されました。各サブクラスからの転写産物の数とその FPKM 値が表示されます。 c 表は、給血原生動物（UP）のトランスクリプトームよりも、給血原生動物（FP）のトランスクリプトームにおいて、16倍を超えるFPKM値で濃縮された上位の差次的発現転写物（DET）を示しています。個々のアクセッション ID は補足表 S3 で入手できます。 c' パネル (c) に示す RNA-seq データによって同定された DET の RT-qPCR 検証。データは、給餌されていないダニと吸血されたダニ (n = 3) の 3 つの独立した RNA 分離株から合成された cDNA セットから得られ、伸長因子 1 (ef1α) に正規化されました。平均値と標準誤差が表示されます。 d 表は、フィルターを適用した、全身のトランスクリプトームよりも中腸のトランスクリプトームに富む DET を示しています: Eval < e-60、カバレッジ ≥ 90%、FPKMAdults ≥ 2。個々のアクセッション ID は補足表 S4 で入手できます。 d'パネル(d)に示すRNA-seqデータによって同定されたDETのRT-qPCR検証。データは、成人女性の少なくとも 4 つの独立した RNA 分離株および成人女性の顕微解剖された中腸 (n ≥ 4) から合成された cDNA セットから得られ、ef1α に正規化されました。平均値と標準誤差が表示されます。 t 検定分析: *p = 0.05–0.01; **p = 0.01–0.001; ***p = 0.0008; ****p < 0.0001; ns は重要ではありません。グラフの背後にあるソースデータについては、補足データ S1 を参照してください。

中腸プロテアーゼは、迅速な血液処理を可能にする主要な酵素スイートであることは明らかです。 D. gallinae の消化タンパク質分解系の完全なレパートリーを明らかにするために、我々はトランスクリプトームライブラリーをマイニングし、個々のプロテアーゼクランおよびファミリーのプロテアーゼをコードする転写物を同定しました。システインプロテアーゼ（主にパパインファミリー）は、特定された中腸リードの大部分によってコードされていることが判明し、すべてのプロテアーゼをコードするリードの約62％を占めています（補足図S2）。同定された10種類のシステインプロテアーゼのうち、6種類のカテプシンI様分子（クランCA、C1ファミリー）と4種類のレグマイン（アスパラギニルエンドペプチダーゼ、クランCD、C13ファミリー）がコードされていた（図3a、b）。カテプシン L5 とレグマイン 4 は吸血によって強く上方制御され、主に成虫 D. gallinae の中腸で発現されるようであり、ダニの中腸における宿主の血液消化に直接関与していることが示されました。カテプシン D 型 (クラン AA、A1 ファミリー A1) の 3 つのアスパルチルプロテアーゼ (AP) が、中腸に豊富な発現パターンで同定されました (図 3b)。興味深いことに、マダニや他の吸血寄生虫の血液消化に関与する重要なパパイン様プロテアーゼであるカテプシンBおよびC（ジペプチジルペプチダーゼI）の相同体はD. gallinaeトランスクリプトームでは同定されませんでした（図3a）。それらの欠如は、中柱頭ダニに共通の特徴であると思われます（図3a）。これは、カテプシンBおよびC、つまり当初はカテプシンBおよびCが欠如している酵素レパートリーの分子的背景に基づくD. gallinaeダニにおける吸血の出現を示しています。寄生虫の血液消化に不可欠です21。

a Dermanyssus gallinae (Dg) トランスクリプトーム (赤い破線の長方形で強調表示) および鋏目の代表的な消化プロテアーゼ相同体の同定。 Lp、リムルス・ポリフェムス。 Pt、Parastatoda tepidariorum (コガネグモ科の代表); Tu、Tetranychus urticae。 Ss、Sarcoptes scabiei; それは、Ixodes scapularisです。 Rm、リピセファルス・マイクロプラス。モ、メタセイウルス・オクシデンタリス。 Vd、Varroa デストラクター。ノースカロライナ州、ネオセイウルス・ククメリス。緑の長方形は存在を示し、白い長方形は閾値 E 値が ≥1e−30 に設定された相同体同定の不在を示します。 Blast検索のセットアップと結果の詳細を補足図S2に示します。 b D. gallinae の個々の発生段階に由来するライブラリーにわたる、選択されたプロテアーゼとその mRNA 転写物の発現値 (FPKM) のリスト。個々のアクセッション ID は補足表 S5 で入手できます。 UP は給餌されていない原音、FP は給餌された原音、FD は給餌された中音、WB は全身。各転写産物の発現分散は、低 (青) から高 (赤) の範囲の色で示されます。

宿主の血液は、タンパク質が豊富であることに加えて、ヘム鉄および非ヘム鉄の豊富な供給源でもあります。ヘムまたは鉄の生物学に関係するタンパク質、例えばフェロケラターゼ、フェリチン2をコードする転写産物の中腸特異的発現は、D. gallinae ダニの中腸における金属恒常性の維持に対するそれらの重要性を裏付けています。ヘムを新たに合成できず、宿主の血液ヘモグロビンからヘムを摂取しなければならないダニとは異なり、D. gallinae ダニはヘムを新たに合成する能力を明らかに示しました。我々は、中腸に富むフェロケラターゼ転写物を含む、ヘム生合成の完全な酵素プロファイルをコードする転写物を同定した（図4a）。この経路の活性をさらに実証するために、標準（図4b）または正確な質量測定（コプロポルフィリノーゲンIII;補足図）のいずれかによって、D.ガリナエの非給餌段階のホモジネートでヘム生合成の安定した中間生成物を同定しました。 S3a)。経路の最終産物であるヘム b は、質量スペクトル内の診断イオンとして [M + 2] + を含むヘミン標準との比較によって同定され（補足図 S3b）、完全に活性なヘム生合成経路を示しています（図 S3b）。 .4c）。さらに、D. gallinae ダニは母親のヘムの沈着を欠く無色の卵を産み（図4d）、マダニで行われるような食事性ヘムの体細胞分布および沈着よりも活発なヘム生合成の概念を支持します22。これは、マダニ 23 と D. gallinae ダニは系統発生的に関連する義務的な吸血動物であるにもかかわらず、それらのヘム生物学の違いについてのもう 1 つの証拠を提供します。

ヘム（左）または鉄（右）のホメオスタシスに関与するタンパク質の表と、Demanyssus gallinae の個々の発生段階に由来するライブラリーにわたるそれらの mRNA 転写物の発現値 (FPKM)。アクセッション番号は補足表 S6 で入手できます。 UP は給餌されていない原音、FP は給餌された原音、FD は給餌された中音。悲しいことに、5-アミノレブリン酸シンターゼ。 pbgs、ポルフォビリノーゲン合成酵素。 hmbs、ヒドロキシメチルビランシンターゼ。 uros、ウロポルフィリノーゲン合成酵素。ウロド、ウロポルフィリノーゲンデカルボキシラーゼ。 cpox、コプロポルフィリノーゲンオキシダーゼ。 ppox、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ。 fech、フェロケラターゼ。ほら、ヘムオキシゲナーゼ。フェル、フェリチン。 tf、トランスフェリン; IRP、鉄応答性タンパク質。 b D. gallinae のナイーブ非給餌段階における Haem b 前駆体の LC/MS 分析。 D. gallinae サンプルの再構成クロマトグラムが上に示され、分析標準の再構成クロマトグラムが下に示されています。 c ヘム生合成の概略図。経路の転写物と代謝物（黒丸）を特定します。 ALA δ-アミノレブリン酸、PBG ポルホビリノーゲン、HMB ヒドロキシメチルビラン、URO ウロポルフィリノーゲン、CPP コプロポルフィリノーゲン、PP プロトポルフィリン。 d. ガリナエダニおよびマダニの卵の写真画像。母体のヘム沈着物の有無を示す色の違いに注目してください。

マダニや他のダニと同様に 22、D. gallinae ダニは、ポルフィリン環から生体利用可能な鉄を遊離させるヘム切断酵素であるヘムオキシゲナーゼをコードしません (図 4a)。したがって、食事から獲得される鉄は非ヘム由来のものでなければなりません。鉄は取り込まれると、細胞内の鉄結合剤によって隔離されます。私たちは、大きな鉄結合フェリチン複合体をコードする 2 つの D. gallinae 転写物を同定しました。フェリチン 1 (fer1) の転写物には 5'UTR 領域に保存された鉄応答要素があり (補足図 S4)、その翻訳後調節が鉄の生物学的利用能に依存していることを示唆しています。さらに、N末端に予測シグナルペプチド（DeepLoc：0.77）を持つフェリチンタンパク質をコードする2番目のフェリチン転写物（fer2）を同定しました（補足図S4）。これは、鉄の組織間輸送におけるその役割を示しています。 D. gallinae トランスクリプトームでは、昆虫 2 型トランスフェリン (メラノトランスフェリン) の単一相同体のみが同定されました (図 4a)。

我々は、発生段階全体で共有される7252個のコード配列（65.2％）を同定し（図5a）、これらはD. gallinaeダニのトランスクリプトームコアを表している。実際、未成熟段階（原音と中音）は、成体とのどの未熟段階よりも多くの転写物を互いに共有しました（図5a）。各段階では、4.4〜5.5％の固有の特異性転写物が発現されました（図5a）。成ダニのライブラリーは、エネルギー維持（アルギニンキナーゼ）および栄養素の貯蔵/分配（ビテロゲニンおよびビテロゲニン受容体;図5b）に関与するタンパク質をコードする非常に豊富な転写物によって特徴付けられました。 I. ricinus ビテロゲニン 1 および 2 のタンパク質一次配列を tBlastN クエリとして使用し、成体の D. gallinae トランスクリプトーム内で、ダニビテロゲニン 22 の相同体をコードする 2 つのビテロゲニン転写物だけでなく、追加のビテロゲニン転写物 (ビテロゲニン 1 様) も同定しました。 3つの転写産物はすべて、成ダニのトランスクリプトーム内で明らかにレベルの上昇を示し、幼若段階のトランスクリプトームにはmRNAが実質的に存在しませんでした（図5b、b'）。別個のビテロゲニンをコードする追加の転写物は、コダダニに特有であると思われ、ここではVg1様として示されています（図5c、補足表S8）。節足動物ビテロゲニンの系統解析により、節足動物の分類学的グループ、すなわち寄生ダニおよびダニ、ダニ目ダニ、クモ、サソリ、カブトガニ、昆虫、および甲殻類を反映するいくつかのビテロゲニンクレードが生成されました（図5c）。ダニ類は、寄生虫目 (ML/BI = 95/1.00) とダニ目 (ML/BI = 84/0.98) の相同体を含む 2 つの十分に支持されたクレードに分かれました。寄生虫配列は、十分にサポートされている Vg1 および Vg2 系統 (両方とも ML/BI = 100/1.00) 内にクラスター化しており、それぞれ 2 匹のダニと 2 ～ 3 個のダニ相同体を含んでいます。 D. gallinae ダニ Vg1 (転写物 IrSigP-350331_FR2_207-2055、タンパク質 ID: MBD2876257.1)、Vg1 様 (転写物 IrSigP-349783_FR3_1-1870、タンパク質 ID: MBD2876000.1) および Vg2 (Dg-9795_FR) 3_189-2089、タンパク質ID: MBD2876256.1) は、対応する Vg 系統内のそれぞれのダニビテロゲニンオーソログとグループ化されました (図 5c)。

ベン図は、段階固有のトランスクリプトームの特異性と、個体発生全体で共有されるトランスクリプトームのコアを示しています。 b 表は、成ダニのトランスクリプトームが豊富な上位の転写物を示しています。これらは、ダニの幼若段階である前幼虫と後幼虫の両方のトランスクリプトームに対して、成虫のトランスクリプトームにおける > 16 倍の FPKM 値によってフィルター処理されました。 E 値 < e−80; タンパク質 ID は補足表 S7 として入手できます。 b' パネル (b) に示す RNA-seq データによって同定された DET の RT-qPCR 検証。データは、成ダニおよび幼ダニの 3 つの独立した RNA 分離株 (n = 3) から合成された cDNA セットから得られ、伸長因子 1 (ef1α) に正規化されました。平均値と標準誤差が表示されます。グラフの背後にあるソースデータについては、補足データ S1 を参照してください。 FPには原音を与え、FDには中音を与えた。 c Vg1 および Vg2 系統内の 3 つの D. gallinae ビテロゲニン相同体の位置を示す 94 個の節足動物ビテロゲニンアミノ酸配列の最尤系統発生。甲殻類のビテロゲニンをアウトグループとして使用しました。メインノードのノードサポートは、それぞれ最尤ブートストラップ値とベイズ推論事後確率で表されます。簡略化のため、非寄生性分類群の相同体は三角形に折りたたまれています。三角形内の数字は、各クレードに含まれる配列の数を示します。 GenBank アクセッション番号については、補足表 S8 を参照してください。

Caenorhabditis 相同体をクエリ配列 24 として使用して、D. gallinae ダニが TOR 媒介の伝達カスケードを通じて摂食状態を伝達するかどうかを評価するために、トランスクリプトームをマイニングし、TOR 複合体システムの発現と発生段階全体にわたって発現しているインスリン/IGF シグナル伝達 25 を特定しました。補足図S5a)。我々はさらに、生体外膜給餌システム26を用いて、TOR複合体阻害剤であるTorin2を添加した鶏の血液をD.gallinae成虫に給餌することにより、ダニの給餌後の生存能力に対するTOR媒介シグナル伝達の影響を評価した27。得られたデータは、Torin2が高阻害剤用量で明らかな用量依存性の吸血後の致死率を引き起こしたことを示しており（補足図S5b）、成ダニにおけるこの経路の摂食後活性の可能性を示しています。

市販の殺ダニ剤および殺虫剤の大部分は、通常、リガンド依存性イオンチャネル (LGIC) とも呼ばれるイオンチャネル受容体のアロステリック部位との相互作用によって、無脊椎動物の神経系を標的とします。このファミリーのメンバーは高度な一次配列類似性を持ち、神経伝達物質分子のリガンド結合部位とイオン伝導性の細孔を形成します。 LGIC は 4 つの主要なファミリーに分類できます 29。そのうちの 1 つは、一連の検証済みの殺ダニ/殺虫標的を伴います。すなわち、タンパク質 N 末端の 15-aa cys ループという非常に特徴的なモチーフを共有する五量体 cys ループファミリーです 30。 31. cys ループ受容体 (cysLGIC) は、ニコチン性アセチルコリン受容体 (nAChR) 32、セロトニン受容体などのカチオン透過性と、γ-アミノ酪酸 (GABA) 依存性イオンチャネル 33、グリシンなどのアニオンを伝導する受容体の両方です。受容体、およびグルタミン酸 (GluCl)、ヒスタミン 34、35 または亜鉛 36 によってゲート制御される塩素チャネル。最後の 2 つ、ヒスタミン依存性塩化物チャネルと亜鉛依存性塩化物チャネルは、D. gallinae トランスクリプトームでは同定されませんでした (補足データ S2)。一部の五量体リガンド依存性イオンチャネルとは異なり、RDL（ディルドリンに対する耐性）-GABA 受容体 28 および GluCl のホモログは無脊椎動物に特有です 37。 RDL-GABA および GluCl は、フィプロニルなどのネガティブモジュレーター、またはイベルメクチンなどのポジティブモジュレーターの標的になる可能性があります38。我々はトランスクリプトームをマイニングし（E値 < e−10、クエリとしてPediculus sp.39とTetranychus sp.40を使用）、cysループ受容体の系統樹を再構築し、cysループの転写物をコードする29個のメンバーを同定した。家族（図6a）。 D. gallinae 転写物は、節足動物および脊椎動物のそれぞれの相同体とともに 9 つのクレードにクラスター化し、さらに 1 つのクレードでは、Acari 特異的グルタミン酸作動性塩素チャネル様タンパク質のみを結合しました。中腸/全身比を見ると、中腸に豊富なmRNA転写物が存在するさらに4つの転写物をフィルタリングして除去した（図6b）。1つはpH感受性クロライドチャネルタンパク質をコードし、3つはAcari特異的クロライドチャネル様タンパク質をコードしている。。次に、GluClをコードする4つの転写物を特定しました。そのうちの2つは中腸特異的発現を示しました（図6c）が、すべての転写物はCysループ領域とほとんどの4つの膜貫通ドメインを持つGluClのコアを共有しています（補足図S6）。 GluClのアミノ酸配列分析により、イベルメクチンとC.エレガンスのGluClアルファチャネルの結合に必要なアミノ酸残基のほとんどが保存されていることが実証されました41（補足図S6）。 4つのGluClホモログのアセンブリは、独自に割り当てられたリードで構成されるIrSigP-571488転写物のコードされたC末端を除いて、複数のリードによってサポートされました（補足図S7）。フィプロニル、イベルメクチン、およびフルララナーによって例示されるように、GluCl チャネルを標的とする殺ダニ剤に対する D. gallinae ダニの感受性を確認するために、成ダニにそれぞれの化合物を微量注射した後の用量依存的な生存率を実験的に決定しました（図 6c'）。。イベルメクチンとフルララナーは 10 μM 溶液の微量注射により数日以内に明らかな致死効果を引き起こしましたが、フィプロニルは 100 μM で注射した場合でも無視できる致死性しか引き起こしませんでした (図 6c')。

a 節足動物および脊椎動物の cysLGIC サブユニットタンパク質配列の最尤系統樹。 50% を超えるブートストラップサポートがメインノードに表示されます。 Dermanyssus gallinae: Dg および IrSig (赤で表示)、Tetranychus urticae: Tu、Drosophila melanogaster (D またはその他)、Apis mellifera (Amel)、Tribolium Castaneum (Tcas)、Homo sapiens (Hs)、Danio rerio (Dr)、Bos taurus (Bt)、Equus caballus (Ec)、Sus scrofa (Ss)、および Gallus gallus (Gg)。アクセッション番号については、補足データ S1 を参照してください。 b 個々のダニ特異的 (Ac) および pH 依存的 (pH) 塩素チャネル (Cls) の FPKM 値、および成ダニの中腸/全身 (WB) 比。 UP は給餌されていない原音、FP は給餌された原音、FD は給餌された中音。 c 個々のGluClのFPKM値と成ダニの中腸/全身比。 c' DMSOに溶解し、溶媒の1%に希釈したGluClアゴニストの微量注入後の用量依存性生存率アッセイ。各データ点は平均値を表し、試験濃度ごとのダニ数 n = 24 または 25 の SEM を表します。グラフの背後にあるソースデータについては、補足データ S1 を参照してください。

自然免疫は、脊椎動物と無脊椎動物の両方にわたる後生動物で高度に保存されています42。無脊椎動物の免疫の体液性部分は微生物の非自己の感知で構成され、その後、ある程度独立して機能する主にTollおよびImdシグナル伝達経路を介したシグナル伝達が続きます43。私たちの研究では、D. gallinaeのトランスクリプトームをマイニングし、完全なToll経路を再構築しました。これは、D. gallinaeの完全な機能を示唆しています（図7a）。欠落している唯一の構成要素は、グラム陰性菌結合タンパク質 (GNBP) と転写因子 DIF でした。ペプチドグリカン認識タンパク質 (PGRP) には、分類が不確かな 2 つの異なる変異体が存在しました。 9 個の Spätzle タンパク質と 8 個の Toll 受容体が同定されました。 IMDとレリッシュを含むほとんどのコンポーネントが欠落しているため、Imd経路は大幅に減少しました。ディフェンシンはおそらく最も広く普及している 3 ～ 5 kDa の抗菌ペプチドであり、動植物界に広く分布し 44、Toll 経路と IMD 経路の両方によって制御されるエフェクター分子です 45。私たちは、複数のディフェンシン関連分子をコードするマダニ Ixodes scapularis ゲノムのデータを使用して、D. gallinae トランスクリプトーム内のディフェンシン様分子を検索しました。この分子は、2 つの主要なファミリーに分類されます：（i）古代無脊椎動物型ディフェンシンと構造的に関連する肩甲骨リシン。 (ii) スカシン。標準的なディフェンシンとは遠縁にすぎません 46。 I. scapularis scasin (Gen Bank EEC18782) に関連する転写物は見つかりませんでしたが、scapularisin-6 (GenBank EEC08935) に対して最も高い相同性を示す、scapularisin に関連するいくつかのディフェンシン様分子を同定しました。 I. scapularis ゲノム (VectorBase ISCW005928)。肩甲骨リシン-6と整列した推定上のディフェンシンをコードする8つのD. ガリナエ転写物の配列（図7b）により、D. ガリナエのディフェンシンが2つの主要なタイプに分類できることが明らかになった：（i）標準的なフリン切断モチーフ（RVRR）を欠くI型ディフェンシン47 (ii) 保存されたフリン部位を有する II 型ディフェンシン。 FPKM 値に基づくと、I 型ディフェンシンはすべての段階ではるかに多く発現しているようです (図 7b)。

a ショウジョウバエまたはトリボリウムのトールおよび Imd 経路のタンパク質配列を使用して、D. gallinae 翻訳タンパク質データベース (ローカル BLAST、E 値 0.1、マトリックス BLOSUM62) を検索しました。ドメインの保存は、CD-search (NCBI) によってチェックされました。類似のドメイン構造および E 値 < 10e-3 を持つ相同配列のみが推定上の相同体とみなされました。アクセッション番号は補足表 S9 として入手できます。 b 同定されたD. ガリナエ成熟ディフェンシンの多重配列アラインメント、ダニIxodes scapularis scapularisin-6（GenBank EEC08935）との相同性、およびD. ガリナエの個々の発生段階に由来するライブラリにわたるディフェンシン転写物の発現値（FPKM）。 Furin切断部位のアミノ酸残基を赤文字で示す。 UP は給餌されていない原音、FP は給餌された原音、FD は給餌された中音。

脊椎動物および無脊椎後生動物の細胞性および体液性自然免疫における主な役割は、複雑な補体系によって担われています48。脊椎動物および無脊椎動物の補体系の中心エフェクター分子は、以前はα2-マクログロブリンスーパーファミリーのタンパク質と呼ばれていた、チオエステル含有タンパク質（TEP）ファミリーに属するタンパク質です48、49、50。無脊椎動物では、TEP ファミリーは、α2 マクログロブリン型 (α2M) の汎プロテアーゼ阻害剤、C3 様補体成分 (C3)、昆虫型 TEP (iTEP)、およびマクログロブリンからなる最大 4 つの主要な系統発生的に異なるグループから形成されます。 -補体関連（MCR）51、52、53。

ここでは、無脊椎動物 TEP の 4 つのグループすべてを表す I. ricinus TEP ファミリーの十分に注釈が付けられた 9 つのメンバーの完全な配列を含む D. gallinae トランスクリプトームを調べました 52,54。 BlastP マイニング、および無脊椎動物 TEP の他の選択された代表を用いた次の系統解析により、D. gallinae が 1 つだけの α2-マクログロブリン分子を発現し、それが少なくとも 5 つのスプライシング変異体 (DgA2M(sv1-5)) によってコードされていたことが明らかになりました (補足図 S8)。さらに、D. gallinae トランスクリプトームには、明らかに昆虫型 TEP (DgTEP) に属する 1 つの分子、1 つの C3 補体様分子 (DgC3) およびそのグループに属する 3 つの分子が含まれていました。マクログロブリン補体関連タンパク質（DgMCR-1、2、3）の（補足図S8）DgMCR-3は、系統発生的に他の2つ、DgMCR-1、およびDgMCR-2からかなり離れているように見えますが、そのメンバーシップはMCR は、MCR クレード内での系統発生上の安定した位置と、分子の中央部分にある特徴的な低密度リポタンパク質受容体ドメインの存在によって裏付けられています 52,54。総合すると、D. gallinae は無脊椎動物の TEP のすべての主要なグループの代表を持っています。、そのほとんどは、発現パターンに実質的な違いを示します（補足図S8）。

節足動物 55 は、高等生物 56 と同様に、RNA 干渉 (RNAi) と呼ばれる RNA ベースの抗ウイルス免疫機構を備えています。この経路は、昆虫の RNA ウイルスと DNA ウイルスの両方に対して機能します 57,58。インシリコ予測と実験的検証の両方が、D. gallinae における機能的な RNAi 経路の存在を裏付けています 59。我々はインシリコ分析を確認し（補足図S9）59、R2D2ホモログ（Evalカットオフ<0.00001;クエリショウジョウバエR2D2：NP_001285720.1）を除いて、RNAiタンパク質性成分をコードするほとんどの転写物を同定した。 dsRNA 結合タンパク質である R2D2 は、エフェクター Ago-RISC 複合体への siRNA のローディングに必須であると報告されています 60。これは、R2D2 ホモログが有翅目昆虫（翼状昆虫目）にのみ存在し、非昆虫節足動物（ダニ、ダニ、甲殻類）には存在しないことを決定した包括的な系統解析と一致しています61。

D. gallinae の完全な RNA 成分を特徴付けるという目的の一環として、節足動物ウイルス発見の標準パイプラインを使用して、ワクモ RNA 配列サンプル中の潜在的なウイルス様配列を検出する検索を行いました。 UP (宿主の吸血にさらされていない) または解剖された中腸 (解剖された内部組織) のライブラリーにウイルス配列が存在することにより、ワクモピコルナ様ウイルス、ワクモデンソウイルス、ワクモビルガからなる本物の D. gallinae バイロームが存在することが証明されました。ウイルス、ワクモ関連シクロウイルス、ワクモ関連ハイポウイルス、ワクモ関連シストウイルスなど（図8a）。さらに、ウェルフリートベイウイルスのヘマグルチニンタンパク質 (HA) に類似した 1.5 kb の転写物 (WFBV、同一性 33.85%、E 値 9e-96) など、いくつかの推定上の転写物がウイルスタンパク質と顕著な相同性を持って同定されました (図8a)。利用可能なすべてのクアランジャウイルスタンパク質をクエリとして使用した追加の tblastN 検索では、オルソミクソウイルスのすべての典型的なコアゲノムセグメントに類似するさらに 4 つの転写物が検出されました。これには、クアランフィルクアランジャウイルスの核タンパク質 (NP) の 1.8 kb 転写物と相同な配列 (QRFV、同一性 30.20%、E 値 6e-57) が含まれていました。これらの構造タンパク質に加えて、多部分 RNA 依存性 RNA ポリメラーゼサブユニットタンパク質 PB1 (Tjuloc ウイルス、同一性 50%、E 値 0)、PB2 (QRFV、同一性 28.90) に対するベストヒットを含む 2.4 kb から 2.5 kb の範囲の 3 つの転写物を発見しました。 %、E 値 9e-94) および PA (Tjuloc ウイルス、同一性 50%、E 値 0)。これらの転写産物は、各ライブラリーのフィルター処理されたリードを使用して洗練され、キュレーションされ、13.5 倍から 47.5 倍の範囲の平均カバー率によって裏付けられた各ゲノムセグメントのコンセンサス配列が生成されました。予想されたサイズの推定ゲノムセグメントにはさらに注釈が付けられ、予想どおり、それぞれが非翻訳領域に隣接した、典型的なクアランジャウイルスの構造タンパク質と機能タンパク質をコードする相補的RNA+鎖に単一のORFを提示しました（図8b）。翻訳されたポリメラーゼサブユニットタンパク質 PB1、PB2、および PA は、保存ドメイン Flu_PB1 (pfam00602、E 値 3.62e-60)、Flu_PB2 (5D98_F、E 値 8.2e-121)、および Flu_PA (4WRT_A、E 値 4.9e) を示しました。 −97）、それぞれ。 NP は Flu_NP ドメイン (3TJ0_B、E 値 7.5e-81) を示し、推定表面 HA タンパク質は典型的なバキュロウイルス gp64 エンベロープ糖タンパク質ドメイン (Bac_gp64、E 値 4.64e-48)、シグナルペプチド (SP) を保持していました。膜貫通のための N 末端と C 末端ドメイン。次に、我々は、FPKMに基づいて対称的な発現パターンに従ってすべてのライブラリで検出されたゲノムセグメントの存在を評価するためにD. gallinaeの多様なライブラリを調査し、セグメントが同じウイルスに対応する可能性を裏付けました（図8a）。予想通り、各ライブラリーでは構造セグメントの発現値が非構造セグメントの発現値よりも高かったが、これは活動性感染の間接的な証拠である(図8a)。これらのゲノムデータ、遺伝的距離、機能的および構造的注釈、および発現プロファイルに基づいて、これらのゲノムセグメントが新規ウイルスに対応することが示唆されます。クアランジャウイルス属内の新種の推定上のメンバーであり、我々は暫定的にワクモクアランジャウイルス 1 (RMQV1) と名付けました。この仮説を支持するために、RMQV1 およびさまざまなオルトミクソウイルスの PB1 および NP タンパク質の系統解析に基づいて進化的洞察を生成しました。得られたツリーは、RMQV1がクアランジャウイルスクレード内にクラスター化していることを明確に示しました（図8c）。要約すると、D. gallinae では、多様で複雑なワクモのバイロームが検出され、特徴付けられました。これには、いくつかのウイルス科の新規ウイルス種が含まれており、宿主の生物学と健康に重要な影響を与える可能性があります。これらのウイルスの疫学的、生態学的、獣医学的な影響を明らかにすることを目的とした今後の研究が正当化される。

a D. gallinae の個々の発生段階に由来するライブラリー全体で、ウイルスセグメントとそのそれぞれの遺伝子量を同定しました。 UP は給餌されていない原音、FP は給餌された原音、FD は給餌された中音。 b ワクモクアランジャウイルス1のゲノムセグメントと予測遺伝子産物を示すゲノムグラフ。黒い長方形はORFコード配列を示し、灰色の長方形はタンパク質を予測し、明るい灰色の長方形は構造ドメインまたは機能ドメインの座標を示します。略称は本文中に記載しております。 (右パネル) 同定されたワクモクアランジャウイルスセグメントの発現値。 c ワクモクアランジャウイルス 1 (アスタリスク) および関連ウイルスの予測 PB1 および NP タンパク質のアラインメントに基づく最尤系統樹。分岐ラベルは FastTree サポート値を表します。スケールバーは部位ごとの置換を表します。

Acari62 では吸血が数回進化しました。吸血節足動物は、非常に豊富なタンパク質源（乾燥重量の 90%）である宿主の血液を急速にタンパク質分解する驚くべき能力を示します。彼らの消化管にある血色素分解装置は、系統発生的に関連する吸血寄生虫の間で共有されていることが示唆され、有望な抗寄生虫標的として注目されています 63。マダニとヒメダニは同じダニ目 (クモ目綱) に属し、どちらも吸血性外部寄生虫に相当しますが、ここで得られたデータは吸血性が独立して出現するという仮説を裏付けています。これは、消化タンパク質分解機構における両者の明らかな違いによって実証されています。硬いダニ (I. ricinus) と柔らかいダニ (Ornithodoros moumata) はどちらも主要なヘモグロビン分解ペプチダーゼとしてカテプシン B に依存しており 64、これはダニ目ダニにも当てはまります 65 が、我々はカテプシン B 様またはカテプシン C 様のプロテアーゼをコードするものを特定しませんでした。 D. gallinae (Mesostigmata ダニ) のトランスクリプトームの転写物。したがって、D. gallinae ダニの血液消化タンパク質分解装置は、主に酸性リソソームプロテアーゼ (レグマイン、カテプシン L、およびカテプシン D) に依存していると考えられます。これらは、成体 D. gallinae 中腸内のすべてのプロテアーゼをコードする読み取りの大部分を占めます。この発見は、酸性 pH でヘモグロビンを消化する D. ガリナエホモジネートの明らかな能力を示し、その活性は E-64 およびペプスタチン A によって阻害され、システインおよびアスパラギン酸プロテアーゼの関与を示すという以前の観察を裏付けるものです 66。ダニの消化性カテプシン L (IrCL1) は、pH 3.5 でピークとなる明らかな血色素分解活性およびアルブミノ分解活性を示すことが知られており、これはダニの腸細胞のエンドリソソーム小胞内でのその酸性作用モードを示しています。したがって、D. gallinae カテプシン L プロテアーゼの関与は、おそらく細胞内の酸性リソソーム内でも、宿主の血液タンパク質消化という同様の生物学的プロセスに役立つのではないかと推測するのが合理的です。さらに、カテプシン L5 とレグマイン 4 の転写物は、ダニと同様に吸血による明らかな中腸特異的な上方制御を示し 68 、宿主の血液タンパク質の消化にそれらが直接関与していることを示しています。しかし、特定の基質と阻害剤に基づいて、D. gallinae 中腸に存在するタンパク質分解活性の詳細なマッピングは、この分野での今後の研究にとって実験的な課題のままです。要約すると、宿主内での給餌 69 が 1 時間未満で、その間にダニは体重を約 10 倍に増加させます 70 が続き、宿主外での急速な消化が続きました。近縁の真皮ダニ Ornithonyssus sylviarum では、吸収された赤血球内容の約半分が 4 ～ 8 時間以内に消化されました。マダニやダニ目ダニ 72 と同様に、寄生虫目吸血ダニ (D. gallinae) 66 は、主に酸性のエンドリソソームタンパク質分解酵素の多酵素複合体を使用して、宿主の血液を細胞内で消化すると思われますが、カテプシン B および C 相同体を欠いています。

現在、D. gallinae ダニが完全なヘム生合成をコードしていることが明らかになっています。しかし、ヘム生合成酵素をコードする個々の転写産物の発現プロファイルの不均一性からは、生合成経路がどの発生段階で活性化するのかが完全には特定されておらず、発生段階や摂食状態に依存する発現パターンはほとんど示されていない。最後のヘム生合成酵素であるフェロケラテーゼをコードする転写物は、部分的に餌を与えられたダニと同様に中腸で著しく豊富であることが示されており、組織が大量の微生物で満たされているため、この時空においてこの酵素の必要性について疑問が生じている。ヘム。 D. gallinae の卵にはヘムの沈着がないことを考えると、母親から取得されたヘムは、マダニの場合のように胚形成と生殖に重要な役割を果たしていない可能性があります 22。このことは、卵が豊富なサンプル 1 mg あたり推定サブピコモルレベルのヘム b を含む、産卵された卵の色の欠如によっても明確に証明されています。これは、ダニの卵に沈着する約ナノモルのヘム b とは著しく対照的です22。

マダニ 74,75 と同様に、D. gallinae は細胞質フェリチンと分泌フェリチンをコードする 2 つの別個のフェリチン遺伝子を含んでいると考えられます。 D. gallinae におけるこれらのフェリチンの両方をコードする転写産物の発現は、中腸における鉄の恒常性における重要な役割を示しています。フェリチン 1 は 5' UTR に鉄応答性要素を持ち、シグナルペプチドを欠いているため、細胞内鉄貯蔵タンパク質として機能すると考えられます。対照的に、分泌型フェリチン 2 は明確な N 末端シグナル配列を持っており、中腸からの鉄の輸送における役割を示唆しており、したがってダニや昆虫と同様に中腸で獲得した鉄の体細胞分布を促進している 75,76。どちらの D. ガリナエフェリチンも、保存されたフェロキシダーゼ二鉄中心 (Fe2+ から Fe3+ への急速な酸化を促進) とフェリハイドライト核形成中心 (核形成と Fe3+ の貯蔵を促進) を持っています。これらは、それぞれ重鎖 (H) フェリチンと軽鎖 (L) フェリチンの特徴的なモチーフを表します。したがって、甲殻類のフェリチンについて実験的に実証され77、ダニのフェリチン1および278について報告されているのと同様に、D. gallinaeのフェリチンは明らかにH型とL型のハイブリッドである。他の者によって行われたRNAi研究では、両方のフェリチンが動物の生存と繁殖に必須であることが実証された。 D.ガリナエダニ79．分泌型フェリチン（この研究では Dg-Fer1 と表記）も、組換え抗原として使用した場合、鶏において D. gallinae ダニに対する抗体媒介防御を与える強力な標的であることが示されています 79。細胞質フェリチンと分泌フェリチンの両方を負荷する鉄の食事源は明らかではありません。しかし、D. gallinae では、ヘムのポルフィリン環から鉄を遊離させる酵素であるヘムオキシゲナーゼの遺伝コードが存在しないことを考えると、マダニについて実験的に決定されているように、生物学的に利用可能な鉄のプールは宿主の血液トランスフェリンから獲得される可能性が高い 22,80。

ここでは、免疫感知およびシグナル伝達のトール経路および IMD 経路、ならびに免疫誘発物質が、既知のホモログの有無に基づいて再構築されました。 Toll 経路全体をマイニングできましたが、IMD 経路は大幅に減少しており、IMD や Relish などの主要なコンポーネントが欠落していました。 D. gallinae ダニで同定された保持メンバーは、昆虫の IMD 経路にも組み込まれており、カスパーゼ (DREDD、システイン依存性 ASPartyl 特異的プロテASE) およびセリン/スレオニンキナーゼ (TAK1 および IKKβ) でした。経路の重要な構成要素である転写因子レリッシュが欠如していること（我々のトランスクリプトームでも、Eval カットオフ = 0.0001 のゲノムでも同定されていない）は、D. gallinae ダニにおける IMD 経路の非機能性を示しました。系統的に関連したダニ、Varroa (Parasitiformes; Eval Cut off < 10e−3) および Metaseiulus (Acariformes) 81。チオエステル含有タンパク質に代表される原始補体系の構成要素について D. gallinae トランスクリプトームをマイニングしたところ、このダニは、マダニ、クモ、さらにはカブトガニなどの他の鋸歯動物と同様に、すべての主要な TEP グループ、すなわち、α2 マクログロブリン、C3 様補体成分、昆虫型 TEP、およびマクログロブリン補体関連 (MCR)。しかし、これらのグループの一部は進化の過程で失われたと思われます。たとえば、甲殻類や六脚類の C3 様分子や、ショウジョウバエや蚊などの一部の昆虫系統の α2M などです。 D. gallinae トランスクリプトームで見つかった単一の α2M は、ダニ α2Ms について以前に報告されている 85,86 ように、おそらく分子捕捉機構 84 によって阻害される標的プロテアーゼのポートフォリオを拡張するために、選択的スプライシングによって「ベイト領域」内で多様化されています。

二酸化ケイ素の散布とは別に、商業的な産卵では、D. gallinae ダニの個体数を制御するために化学合成された駆虫薬が使用されています。商業的に成功している殺ダニ剤のほとんどは、イオンゲート型塩素チャネルを標的としており、鶏舎内の D. gallinae ダニの制限または排除につながります 87。 DMSO に懸濁した選択された市販の殺ダニ剤の微量注入とその後の滅菌 PBS での 100 倍希釈を使用して、D. gallinae ダニの用量依存的な生存率を評価しました。異なる投与経路を利用した以前の研究と同様に、フルララネルとイベルメクチンの微量注射後のダニの明確な時間および用量依存性致死性が確認できましたが、微量注射によって投与されたフィプロニルの殺ダニ効果は観察されませんでした。。この観察は、以前に報告された、フィプロニル溶液への局所曝露に対する D. gallinae ダニのより低い不均一な感受性と一致している可能性があります 89。ダニに特有の塩素チャネルに関する知識はありませんが、他の無脊椎動物の pH 感受性塩素チャネルに関する研究は増えています。興味深いことに、カイコ由来の pH 感受性塩化物チャネルはイベルメクチンには感受性ですが、フィプロニル 90 には非反応性であり、これはアゴニストの微量注入時の生存率アッセイからの我々のデータを思い出させます。これは、pH依存性塩素チャネルがイベルメクチンのようなチャネルアゴニストにとって殺ダニ活性を引き出す重要な標的である可能性があることを示唆している可能性がある。

D. gallinae は、家禽を衰弱させる世界的な害虫です。詳細な分子理解のための最近の基礎的基礎により、おそらく吸血ダニに固有の新規殺ダニ標的が同定され、検証される可能性がある。今回我々は、吸血ダニと非給餌ダニ、全身および顕微解剖した中腸を比較して、新しい D. gallinae トランスクリプトームを配列決定して組み立てました。これらは、義務的な吸血ライフスタイルに対するこの外部寄生虫の分子的適応についての洞察を可能にする重要な有益なデータセットを表しています。また、ターゲットベースの殺ダニ剤開発に適した潜在的なターゲットのカタログも提供されます。組み立てられたコンティグ、アノテーション、およびそれぞれの式の値のシーケンスは、使いやすい一体型のハイパーリンクされた Excel シートから利用できます (「データの利用可能性」を参照)。これまでの研究とは異なり、RNA-seq に基づく研究は、人工膜供給プラットフォーム、ヘモコアエルマイクロインジェクションを介して実行される生存率アッセイ、および質量分析による代謝産物の同定によって補完されています。最後に、我々は D. gallinae に特異的な RNA バイロームを特定し、懸念される可能性のあるウイルスを強調しました。この研究は、収集および精選されたイルミナ由来のデータの統合的評価を提示し、D. gallinae の吸血ライフスタイルに本質的に関連する分子特性を記述し、新しいウイルス変異体の保有者としての新たな役割を明らかにします。

ダニは、国際家禽検査ウストラシツェ (MTD ウストラシツェ、チェコ共和国) の採卵鶏のケージをブラッシングすることによって収集されました。ダニは、FlyPad (Flystuff.com) を使用して CO2 で短時間麻酔され、原幼虫、中幼虫、成虫の 3 つの発育段階に分けられました。原虫はさらに、給餌されていないダニと吸血されたダニに分類されました。中腸を成体段階から顕微鏡で解剖した。ダニを腹側を下にして両面粘着テープの上に置き、カミソリで首を切り落とし、中腸をジエチルピロカーボネート（DEPC）処理リン酸緩衝食塩水（PBS）滴の中に引き抜きました。異なる発育段階のダニ全体 (各 n = 30) をエッピ乳棒でホモジナイズし、中腸 (n = 40) を 29 G インスリン注射針を使用してホモジナイズしました。 NucleoSpin RNA キット (Macherey Nagel) を使用してホモジネートから全 RNA を抽出し、RNase フリーの水に溶出し、全 RNA の収量は 2 ～ 7 μg でした。 Agilent 2100 BioAnalyser は、RIN 値 ≥ 9 で RNA の品質を評価しました。非鎖 cDNA ライブラリーは、NEBNext® Ultra™ RNA Library Prep Kit for Illumina® によって調製され、Novagene Co., Ltd. の NovaSeq600 で 150 bp として配列決定されました。ペアエンド読み取り。

トランスクリプトームのアセンブリとコード配列の抽出は、以前に記載されているように実行されました92。簡単に言うと、リードから汚染プライマーを取り除き、プログラム Trim Galore (Krueger F. Trim Galore: Cutadapt および FastQC のラッパーツール。Trim Galore. 2012) を使用して等しい値 < 20 の塩基をトリミングしました。クリーンリードは、Abyss93 および Trinity94 アセンブラーを使用してアセンブルされました。これらのアセンブリは、前述したように、blastn および cap3 アセンブラ 95 の並列パイプラインを使用してマージされました 96。 200 ヌクレオチドより大きいすべてのオープンリーディングフレームを抽出し、既知のタンパク質と一致するもの、またはシグナルペプチドを持つものは保持されました。得られたペプチドおよびコード配列は、いくつかのデータベースとの blastp および rpsblast の一致、シグナルペプチド 97、膜貫通ドメイン 98、および O-ガラクトシル化部位 99 の表示を含む、ハイパーリンクされたスプレッドシートにマッピングされました。特定の発達段階に割り当てられた転写物は、16 倍の変化因子によってフィルター処理されました。つまり、「成人特異的」転写物を示すために、その FPKM 値は、FP のトランスクリプトームにおける FPKM 値の 16 倍を超え、同時に、給餌されたdeutonymphsのトランスクリプトームにあります（「データの利用可能性」を参照）。フィードオーバー UP のトランスクリプトームに富む転写物をリストするために、明確な注釈 (E 値 < e-100)、カバレッジ > 10%、および FP > 5 の FPKM を持つ転写物のみを考慮しました。次に、最も高い給餌/非給餌比に従って転写物をリストしました。

上記のように、3 ～ 5 つの独立した生物学的複製でトータル RNA サンプルを調製しました。 30 匹のダニ (全身) または 40 匹の成ダニの中腸を RNA 抽出に使用し、1 回の抽出あたり約 1 μg の RNA を生成しました。ただし、成虫 (全身) のサンプルは 1 回の抽出あたり約 8 μg の RNA を生成しました。 First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche) とオリゴ(dT)18 プライマーを使用して、0.2 μg の全 RNA から一本鎖 cDNA を逆転写しました。 RT-qPCR では、cDNA をヌクレアーゼフリーの水で 10 pmol の各プライマーとともに 10 倍に希釈し、384 ウェルプレート (MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate、Thermo Fisher Scientific、米国) で 10 μL の反応を実行しました。 QuantStudio™ 6 Flex リアルタイム PCR システム (Thermo Fisher Scientific、米国) で FastStart Universal SYBR Green Master (Rox) (Roche Life Sciences) を使用します。この研究で使用したプライマーは、補足表 S3、S4、および S7 にリストされています。

節足動物ビテロゲニンの系統解析に使用されたデータセットは、ダニ、ダニ、ダニ、クモ、サソリ、カブトガニ、昆虫、甲殻類の相同体を表す 67 アミノ酸配列で構成され、後者はアウトグループです (補足表 S8)。ビテロゲニン配列は、GenBank の注釈付きエントリとして取得されるか、tBlastN アルゴリズムおよび E 値カットオフ < 10-5 を使用して GenBank で利用可能なゲノム/トランスクリプトームアセンブリからマイニングされました。構造的に類似したダニのヘムリポ糖タンパク質 (例: GenBank: ABK40086 および ACF35055) および GenBank でビテロゲニンとして注釈が付けられているそれらの関連ダニ配列 (例: GenBank: AXP34688、BAJ21514、AXP34687、XP_029826448) は分析に含まれませんでした。タンパク質は真のビテロゲニン相同体ではありません。ビテロジェニン配列は、Geneious Prime v2019.0.4101 に実装された MAFFT (v 7.017)100 で、アライメント戦略の自動選択と、ギャップオープニングペナルティ (1.53) およびオフセット値 (0.123) のデフォルトパラメーターを使用してアライメントされました。最小ブロック長を 5 に設定し、ギャップ位置の半分を許可することを除き、デフォルトパラメーターの下で GBlocks v0.91b102 を使用して、アラインメントの非相同領域をトリミングしました。そのため、最終的なアラインメントは、典型的な 3 つの構造ドメインを含む 3578 アミノ酸位置で構成されました。ビテロゲニン (すなわち、ビテロゲニン N 末端領域、機能不明のドメイン [DUF1943]、およびフォンヴィレブランド因子 D 型ドメイン)。系統樹は、ModelFinder104 で選択された LG + F + R6 タンパク質モデルを使用して、IQ-TREE v1.6.12103 の最尤法 (ML) 法によって再構築されました。ブートストラップは 1000 回の複製に基づいていました。ベイジアン推論 (BI) 分析は、100 ツリー間隔でサンプリングされた 4 つの同時 MCMC チェーンと 200 万世代から推定された事後確率を使用して、CIPRES Science Gateway v3.3106 に実装された MrBayes v3.2.7a105 で実行されました。 ModelFinderで選ばれたのはWAG+F+G4の進化モデル。バーンイン期間は全世代の 10% を占めました。ツリーは Geneious Prime v2019.0.4 で視覚化され、Adobe Illustrator CS5 でグラフィカルに変更されました。

cys ループリガンド依存性イオンチャネル遺伝子ファミリーの系統解析には、Dermauw et al.40 のデータセットに対応し、D. gallinae のホモログが豊富に含まれる 121 アミノ酸配列からなるデータセットを使用しました。データS1)。 GenBank の注釈付きエントリーから取得した配列をアラインメントし、ビテロゲニンデータセットについて前述したように処理しました。最終的なアラインメントは 502 個のアミノ酸位置から構成されました。 ML に基づく系統樹とその節点サポートは、ビテロゲニンについて説明したように、LG + I + G4 タンパク質モデルを使用して計算されました。

チオエステル含有タンパク質 (TEP) ファミリーの系統解析用に、データセットには D. gallinae TEP の 29 アミノ酸配列と、ショウジョウバエ D. melanogaster、堅ダニ I. ricinus、およびカブトガニ由来の無脊椎動物ホモログが含まれていました。 L.ポリフェムス（補足図S8）。ビテロゲニンデータセットについて上で説明したように、配列をアラインメントして処理しました。完全なアミノ酸配列 (約 1500 残基) の最終的なアラインメントは、2737 アミノ酸位置で構成されていました。 ML に基づく系統樹とその節点サポートは、ビテロゲニンについて説明したように、BLOSUM62 + G タンパク質モデルを使用して計算されました。

メタボローム解析のために、鶏舎内でブラッシングにより収集したダニを紙蓋付きの 1 L ボトルに入れ、21 °C の暗所で保存しました。翌日、卵、幼虫、および UP の混合物を上記のように選別しました。次に、21.4 mg のダニからの主な UP 画分を含む非給餌期のサンプル (宿主由来のヘム中間体の検出を防ぐため) を、150 μL の冷抽出媒体、MeOH:ACN:H2O (2:2: 1 v/v/v)、内部標準 4-フルオロフェニルアラニン (0.5 ng/μL を 100 μL) を含みます。次に、Tissue Lyser II (Qiagen、プラハ、チェコ共和国) を使用して、50 Hz、0 °C で 5 分間サンプルを均質化しました。次に混合物を 7000 RPM、5 °C で 10 分間遠心分離し、上清を 0.2 μm PVDF ミニスピンフィルター (HPST、プラハ、チェコ共和国) を通して 8000 RPM、5 °C で 10 分間濾過しました。最後に、上清の 50 μL アリコートを液体クロマトグラフィー高分解能質量分析 (LC-HRMS) に使用しました。 LC-HRMS 方法については、以前に詳細に説明しました 107,108。簡単に説明すると、ヘム生合成の中間体のプロファイリングには、Dionex Ultimate 3000 液体クロマトグラフ (すべて Thermo Fisher Scientific、サンノゼ、カリフォルニア州、米国) と組み合わせた AQ Exactive Plus Orbitrap 質量分析計を使用しました。代謝物は、150 mm × 4.6 mm id、5 μm、SeQuant ZIC-pHILIC (Merck KGaA、ダルムシュタット、ドイツ) で、移動相流速 450 μL/min、注入量 5 μL、カラム温度で分離されました。 35℃。移動相は次のとおりです: A = アセトニトリル、B = 20 mmol/L 炭酸アンモニウム水溶液 (pH = 9.2; NH4OH で調整)。勾配: 0 分、20% B; 20 分、80% B; 20.1 分、95% B; 23.3 分、95% B; 23.4 分、20% B; 30.0 分 20% B。Q-Exactive 設定は次のとおりです。質量範囲 70 ～ 1000 ダルトン。 70,000 解像度 (m/z 200; 3 × 106 自動利得制御 (AGC) ターゲットおよび最大イオン注入時間 (IT) 100 ミリ秒; ポジティブモードで動作するエレクトロスプレー: スプレー電圧 3000 kV、キャピラリー温度 350 °C、シースガス 60 au、補助ガス 20 au、予備ガス 1 au、プローブ温度 350 °C、S レンズレベル 60 au データは、XcaliburTM ソフトウェアバージョン 4.0 (Thermo Fisher Scientific、サンノゼ、カリフォルニア州、米国) を使用して処理しました。研究で使用した化合物: 脱イオン水は、Direct Q 3UV 精製システム (Merck、チェコ共和国プラハ) を使用して調製しました。メタノールおよびアセトニトリル (OptimaTM グレード) は、Fisher Scientific (チェコ共和国、パルドゥビツェ) から購入しました。炭酸アンモニウム、25%アンモニア溶液、4-フルオロフェニルアラニン、5-アミノレブリネート、ヘミン、ポルフォビリノーゲンおよびプロトポルフィリン IX (Merck (プラハ、チェコ共和国) 製) ヘム b の量は、標準のピーク面積に基づいて推定されました。

ダニを上記のように収集し、保管した。 14 日後、生き生きとした個体が選択され、生体外摂食実験に使用されました。供給ユニットは、膜 (シリコンを含浸させたゴールドビーターのスキン) によって 2 つの等しいチャンバーに水平に分割されたプラスチックシリンダー (直径 17 mm、長さ 70 mm) でした。上部チャンバーには、阻害剤 Torin2 (Sigma-Aldrich、カタログ番号 SML1224) を補充した新鮮な脱線維素処理 (4 mm ガラスビーズとの混合による) 鶏血液 2 mL が入っていました。膜給餌装置の下部チャンバーにはダニが含まれていました。給餌ユニットを 41 °C に設定したインキュベーター内の暗所に置きました。 5 時間後、餌を与えた個体を収集し、21 °C に設定したインキュベーター内の 1.5 mL 微量遠心管 (各 10 個体) に保管しました。ダニの生存率と活力を 7 日間 24 時間ごとに監視しました。 Torin2 を DMSO に溶解し、最終濃度 500、250、100、10、および 1 μM までさらに希釈しました。ＤＭＳＯストックを血液ミール中で１％ｖ／ｖＤＭＳＯとなるように血液ミール中で希釈した。

ダニを上記のように収集し、新たに餌を与えた成虫メスを選別した。ダニを粘着テープ上に固定し、13.8 nL の試験化合物 (≦ 1% v/v DMSO) をダニの血腔 (Drummond、USA) に微量注入しました。 10 分後、注射されたダニを 1.5 mL 微量遠心管に集め (各濃度につき 5 匹のエピチューブに 5 匹、または 3 本のエピチューブに 8 匹)、21 °C に設定したインキュベーターに保存しました。ダニの生存率と活力を 7 日間、24 時間ごとに監視しました。研究で使用された化合物: フィプロニル (Sigma-Aldrich Supelco、カタログ番号 16785)、Fluralaner (Cayman Chemical、商品番号 22061)、イベルメクチン (Sigma-Aldrich、カタログ番号 I8898)。

ウイルスの発見、検出、特性評価は、他の場所で説明されているように実装されました109。簡単に言うと、この研究で生成されたトランスクリプトームアセンブリをウイルス発見の入力として使用しました。ウイルスタンパク質配列の完全な NR リリースは、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/?term=txid10239[Organism:exp] から取得されました。統合されたワクモ RNA アセンブリは、ローカルサーバー内の完全に予測された非重複ウイルスタンパク質をプローブとして使用して、複数の tBlastN 検索 (最大 E 値 = 1 × 10−5) によって評価されました。有意な相同性は手動でスクリーニングされ、重複するコンティグは破棄されました。潜在的なウイルス様配列は、Bowtie 2 v2.4.4110 を使用したリードの反復マッピングによって厳選されました。オープンリーディングフレーム (ORF) は、ORFinder によって予測されました。予測されたタンパク質は、NCBI での BlastP 検索と、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml に実装されている保存ドメインデータベース (CDD) v3.19 に対するドメインベースの Blast 検索の対象となりました。 SMART http://smart.embl-heidelberg.de/、Pfam http://pfam.xfam.org/、PROSITE http://prosite.expasy.org/、および HHPred https://toolkit.tuebingen で補足されています。 mpg.de/tools/hhpred は、より多様な機能ドメインを特徴づけます。シグナルおよび膜ペプチドは、SignalP v4.1111 を使用して評価されました。ウイルス RNA レベルは、Cufflinks http://cole-trapnell-lab.github.io/cufflinks/ を使用するか、Geneious suite 8.1.9 (Biomatters Inc.) を使用して、マップされた 100 万リードあたりのウイルス転写物のキロベースあたりのフラグメント数 (FPKM) として計算されました。）。進化的洞察は、予測されたウイルスポリメラーゼまたはカプシドタンパク質のアミノ酸配列の MAFTT (v 7.310) 100 アラインメントによって解決されました。これらは、FastTree の近似最尤系統樹 http://www.microbesonline.org/ に基づく系統解析に使用されました。 fasttree/ を標準パラメータで実行します。個々のノードのサポートは、下平・長谷川のような手順による近似尤度比検定を使用して評価されました。サイトごとのツリートポロジ、サポート値、および置換は 1000 個のツリーのリサンプルに基づいています。ほとんどの配列解析結果は、Geneious suite 8.1.9 (Biomaters Inc.) を使用して統合され、視覚化されました。ウイルスゲノム図は、Adobe Photoshop C3 バージョン 10 を使用して設計されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

データは、nt および aa fasta ファイルを含む BioProject PRJNA597301 として入手でき、ハイパーリンクされた Excel シートは https://proj-bip-prod-publicread.s3.amazonaws.com/transcriptome/Dermanyssus_gallinae/Derm_gallinae.zip からダウンロードできます。。ウイルス配列は、次の GenBank アクセッション番号で NCBI に寄託されました。

RMACTV1-L、ON160022;RMACTV1-S、ON160023;RMQV1-HA、ON160024;RMQV1-NP、ON160025; RMQV1-PA、ON160026;RMQV1-PB1、ON160027;RMQV1-PB2、ON160028;RMDIV1、ON160029; RMIV1、ON160030;RMDEV1、ON160031;RMVLV1、ON160032;RMVLV2、ON160033;RMACYV1、ON160034;RMAHV1、ON160035。

図 4b の生成に使用された生データは、次の DOI で Figshare リポジトリに保管されました: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.22658317.v1、https://doi.org/10.6084/m9.figshare .22658338.v1、https://doi.org/10.6084/m9.figshare.22658386.v1、https://doi.org/10.6084/m9.figshare.22658458.v1。

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この研究は主に、チェコ共和国技術庁の ZETA プログラム (JP への助成金番号: TJ02000107) によって支援され、さらにチェコ科学財団助成金番号 22-18424M (JP へ)、20-05736S および 21-08826S から PK によって支援されました。そして、欧州地域開発基金（ERDF）と教育・青少年・スポーツ省の資金提供を受けた「寄生虫の病原性と毒性研究センター」（No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759）による。（メイス）。 JMCR は、国立アレルギー感染症研究所の学内研究プログラム (ベクター媒介疾患: ベクター宿主関係の生物学、Z01 AI000810-20) によって支援されました。この研究では、NIH HPC Biowulf クラスター (http://hpc.nih.gov) の計算リソースを利用しました。グラフィカルな視覚化については、Martina Hajduskova 博士 (www.biographix.cz) に感謝します。原稿査読者の建設的なご批判にも感謝いたします。

José M. Ribeiro、David Hartmann などの著者も同様に貢献しました。

米国メリーランド州ベセスダ、国立アレルギー感染症研究所、マラリアおよびベクター研究研究所

ホセ・M・リベイロ

寄生虫学研究所、生物学センター、チェコ科学アカデミー、37005、チェスケーブジェヨヴィツェ、チェコ共和国

デヴィッド・ハートマン、パヴラ・バルトショヴァ＝ソジコヴァ、マルティン・パルス、マチェイ・クチェラ、オンドジェ・ハイドゥシェク、ダニエル・ソイカ、ペトル・コパチェク、ヤン・ペルナー

国立農業技術研究所農業研究センター植物病理学研究所 (IPAVE-CIAP-INTA)、コルドバ、アルゼンチン

ウンベルト論争

昆虫学研究所、生物学センター、チェコ科学アカデミー、37005、チェスケーブジェヨヴィツェ、チェコ共和国

マーティン・ムース & ペトル・シメク

国際家禽試験所ウストラシツェ、ウストラシツェ、チェコ共和国

イジー・ファラ

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概念化 (DH、PK、JP)、方法論 (JMR、DH、PBS、HD、MM、P.Š.、JF、MP、MK)、検証 (DH、PBS、MM)、形式分析 (JMR、DH、PBS) 、HD、MM、OH、DS、PK、JP)、調査 (JMR、DH)、リソース (JMR、HD)、データキュレーション (JMR、HD)、執筆 - 原案 (JP)、執筆 - レビューおよび編集 ( JMR、DH、PBS、HD、MM、P.Š.、OH、DS、PK、JP)、ビジュアライゼーション (JMR、DH、PBS、HD、MM、OH、DS、PK、JP)、プロジェクト管理 (JP) 、資金調達（JMR、PK、JP）。

ヤン・ペルナーへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた Ben Mans、Han Xia、およびその他の匿名の査読者に感謝します。主な取り扱い編集者: Luke R. Grinham。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Ribeiro、JM、Hartmann、D、Bartosová-Sojková、P et al. RNA配列に基づく家禽ワクモDermanyssus gallinaeの吸血適応とバイローム評価 Commun Biol 6、517 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04907-x

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受信日: 2022 年 5 月 20 日

受理日: 2023 年 5 月 3 日

公開日: 2023 年 5 月 13 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04907-x

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