フルクトースの分子特性と免疫効果

寄生虫とベクター 16 巻、記事番号: 169 (2023) この記事を引用

224 アクセス

2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

マダニは、人間、野生動物、家畜にさまざまな病原体を媒介する偏性吸血性外部寄生虫です。 ワクチン接種はダニ駆除のための効果的で環境に優しい方法です。 フルクトース-1,6-二リン酸アルドラーゼ (FBA) は、寄生虫に対するワクチンの候補となる重要な糖代謝酵素です。 しかし、マダニにおける FBA の免疫保護は不明です。

363 アミノ酸のタンパク質をコードする Haemaphysalis longicornis 由来の FBA (HlFBA) の 1092 bp オープン リーディング フレーム (ORF) を、PCR 法を使用してクローニングしました。 原核生物発現ベクター pET32a(+)-HlFBA を構築し、タンパク質発現のために大腸菌 BL21(DE3) 株の細胞に形質転換しました。 組換え H1FBA タンパク質 (rH1FBA) はアフィニティー クロマトグラフィーによって精製され、ウェスタン ブロットの結果は、rH1FBA タンパク質が免疫原性であることを示唆しました。

酵素結合免疫吸着アッセイの結果は、rH1FBA で免疫したウサギが rH1FBA に特異的な体液性免疫応答を生成したことを示しました。 マダニ寄生試験では、ヒスチジンタグ付きチオレドキシン（Trx）群のマダニと比較して、rHlFBA 群の雌マダニの満腹したマダニの体重と産卵、卵の孵化率が 22.6%、45.6%、そして 45.6% 減少したことが示されました。それぞれ24.1%。 これら 3 つのパラメーターの累積効果に基づいて、rH1FBA の全体的な免疫有効性は 68.4% と推定されました。

FBA は、充血したダニの体重、産卵、および卵の孵化率を大幅に低下させることができる抗ダニ ワクチンの候補です。 グルコース代謝に関与する酵素の使用は、抗ダニワクチン開発における新しい戦略です。

マダニは必須吸血節足動物であり、世界中の人間や動物にとって主要な病原体媒介者です[1]。 マダニとそれが媒介する微生物はどちらも人間と獣医の健康にとって重大な脅威です[2]。 Haemaphysalis longicornis (ダニ:マダニ科) は東アジア原産のマダニの一種で、オーストラリア、ニュージーランド、およびいくつかの太平洋の島々に定着しています [3]。 Theileria uilenbergi、Babesia motasi、Rickettsia hebeiii、Anaplasma phagocytophilum などの病原体を媒介します [4,5,6,7]。 また、ヒトと動物の健康を危険にさらす重症熱性血小板減少症候群ウイルス (SFTSV) の媒介体でもあります [8]。 したがって、抗 H. ロンギコルニスワクチン[9、10]。

ガレーら。 は、H. ロンギコルニス由来の 2 種類の鉄結合タンパク質フェリチン (HlFER)、細胞内 HlFER1 と分泌型 HlFER2 を抗ダニ ワクチンとして評価しました [11]。 ウェスタンブロットの結果は、抗体が組換えH1FER（rH1FER）と交差反応し、天然のH1FERとも反応することを実証した。 マダニ攻撃実験により、rHlFER2を接種したウサギを与えたマダニは、対照群のマダニよりも充血体重が低いことが実証された。 産卵および孵化率は、rH1FER接種グループの両方で低下しました。 rHlFER1 および rHlFER2 のワクチン有効性は、それぞれ 34% および 49% でした [11]。 別の研究では、H. ロンギコルニス スオレシン (HlSu) のオープン リーディング フレーム (ORF) が同定され、組換え HlSu (rHlSu) が大腸菌で発現されました [12]。 rHlSuで免疫したウサギは免疫応答を引き起こした。 rHlSuで免疫したグループでは、雌ダニの充血重量と産卵は対照グループよりも有意に低かった。 計算されたワクチンの有効性は 37.4% と推定されました [12]。 その後の研究で、Wang et al. H. ロンギコルニス リポカリンホモログ (HlLIP) 遺伝子を pET-32(a+) にクローニングして、組換えタンパク質 (rHlLIP) を取得しました。 RH1LIP の免疫原性はウェスタンブロットによって確認されました [13]。 H. ロンギコルニスに感染したウサギでの免疫試験では、rH1LIP タンパク質に対する抗体が充血重量、産卵および孵化率を低下させることが示されました (rH1LIP タンパク質のワクチン有効性は 60.17%)。 しかし、今日まで、市販の抗 H. ロンギコルニス ワクチンは現在利用できないため、H. ロンギコルニスの侵入に対する効果的な防御抗原をスクリーニングすることが重要です。

フルクトース-1,6-二リン酸アルドラーゼ（FBA）は、フルクトース-1,6-二リン酸からグリセルアルデヒド-3-リン酸とジヒドロキシアセトンリン酸、または逆アルドールアルコール縮合反応を触媒する酵素です[14]。 FBA は、多くの感染症で免疫応答を誘導することができ [15]、多くの病原体に対する広域ワクチンとしても使用できます [16、17、18、19、20]。 ある研究では、組換えFBA (rFBA) + フロイントアジュバントを接種したマウスは、肺炎球菌攻撃に対する免疫防御を獲得しました[21]。 フロイントアジュバント単独と比較して、rFBA + フロイントアジュバントはマウスの記憶 CD4+ T 細胞の増殖を増加させ、生存率を大幅に増加させました。 マウス抗rFBA血清も、免疫前血清と比較して、致死性肺炎連鎖球菌攻撃に対してマウスを有意に保護した[21]。 これらのデータは、rFBA が肺炎連鎖球菌に対する防御ワクチンの候補であることを示唆しています。 マッカーシーら。 Onchocerca volvulus FBA (OvFBA) に免疫原性があることが確認されました。 組換え OvFBA のマウスにおける保護効果をテストしたところ、幼虫の生存率は 50% 減少しました [16]。 これらのデータは、動物モデルにおけるワクチン候補としてのこの酵素のさらなる研究を裏付けています。

本研究では、H.longicornis から FBA の ORF (HlFBA) をクローニングし、大腸菌を使用して組換え HlFBA タンパク質 (rHlFBA) を発現させました。 次に、ウサギに免疫を与えてその免疫防御効率を分析しました。 この結果は、H1FBA が H. ロンギコルニス感染に対する有用なワクチンである可能性があることを示しています。

H. ロンギコルニスの成虫は、5 月に河北省小五台​​国家自然保護区の羊から収集され、前述のように研究室に送られました [22]。 非寄生期間中、ダニは保育器内で維持されました。 寄生段階では、ニュージーランド白ウサギの耳にダニを与えました。 実験のために、次世代の成ダニがさまざまな発達段階で収集されました。 すべての動物実験は、河北師範大学動物倫理委員会の承認されたプロトコール（#2021LLSC035）に従って実施されました。

以前に記載されているように、さらなる相補的 DNA (cDNA) 合成のため、TRIzol (TransGen、北京、中国) 試薬を使用して、H. ロンギコルニス成体雌からの全 RNA を抽出しました [23]。 H1FBA 遺伝子 (HlFBA) の ORF を増幅し、プライマー 5'-ATGGCTGGCCACTTCAC-3' および 5'-TCAGTACTCGTGGTTTTTGATA-3' を使用してクローニングしました。 H1FBA は、次のステップからなる PCR サイクルによって取得しました。94 °C で 3 分間の前変性。 94℃で30秒間の変性、60℃で30秒間のアニーリング、72℃で60秒間の伸長を30サイクル。 最終伸長は 72 °C で 10 分間。 得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、続いて標的バンドを回収してpEASY-T1ベクターにライゲーションし、続いて配列決定のためにTRANS-T1細胞(TransGen)に形質転換した。 正しい遺伝子配列をアミノ酸配列に翻訳し、続いて DNAMAN 8.0 (Lynnon Biosoft、ケベック、オンタリオ州、カナダ) を使用して多重配列アラインメントを行いました。

雌マダニのさまざまな発育段階（卵、幼虫、若虫、成虫）およびさまざまな器官（唾液腺、中腸、卵巣、マルピーギ管）からのHlFBAの転写プロファイルを、定量的リアルタイムPCR（qRT-PCR）によって推定しました。 Ｈ１ＦＢＡの特異的プライマーを設計した（フォワードプライマー：５'－ＴＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＧＧＴＧＣＧＴ－３'；リバースプライマー：５'－ＧＴＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＧＡＣ－ＡＴＴ－３'）。 H. ロンギコルニス β-アクチン遺伝子 (AN AY254898) の相対発現を使用して、HlFBA 発現データを正規化しました [24]。 遺伝子発現データは 2-ΔΔCt 法により計算されました [25]。 すべての分析は、3 つの技術的複製と 3 つの生物学的複製を使用して実行されました。

EcoRIおよびHindIII制限部位を含むプライマー(フォワードプライマー:5'-GAATTCATGGCTGGCCACTTCAC-3';リバースプライマー:5'-AAGCTTTCAG-TACTCGTGGTTTTTGATA-3')を使用して、PCRによってHlFBAを増幅した。 PCR産物をアガロース電気泳動で分離し、DNAゲル回収キット（BioTeke Corp.、北京、中国）を使用して標的遺伝子を回収し、pET-と名付けられた原核生物発現プラスミドpET-32a（+）（TransGen）に挿入しました。 32a(+)-HlFBA。 rH1FBA を発現させるために、プラスミドを大腸菌株 BL21(DE3) (タカラバイオ株式会社、滋賀県) の細胞に形質転換し、細胞を 10 μg/ml アンピシリン ( TransGen) を 37 °C、200 rpm で一晩洗浄し、その後、それらを使用して 100 ml の培養物に接種しました。 rH1FBA タンパク質は、25 °C で 0.5 mM イソプロピル-β-d-1-チオガラクトピラノシド (IPTG) によって誘導され、細胞培養上清はイミダゾール勾配 (20 mM、50 mM、100 mM、 200 mM および 500 mM) を Ni に溶解します。 Sepharose 6 Fast Flow クロマトグラフィー樹脂 (GE Healthcare、米国イリノイ州シカゴ)。 rH1FBA タンパク質は、Bradford 法 [26] を使用して定量されました。 プラスミド pET-32(a+) によって発現されたヒスチジンタグ付きチオレドキシン (Trx) タンパク質を、上記の手順を使用して精製しました。

餌を与えていない雌ダニ 10 匹を液体窒素中で粉砕し、1 ml の 0.1 M リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) を含むチューブに移しました。 4℃、13,000 rpmで10分間遠心分離した後、フロイントの完全アジュバントと混合した500μgのダニタンパク質をウサギに注射した。 続いて、フロイントの不完全アジュバントと混合したダニタンパク質500μgを2週間間隔で2回注射した。 最後の免疫後１４日目に血清を収集し、カプリル酸－硫酸アンモニウム沈殿法により精製して、ウサギ抗Ｈ． ロンギコルニス血清。

染色済みタンパク質マーカー (TransGen)、精製 rHlFBA、および pET-32a(+)-HlFBA を含む IPTG 誘導大腸菌を含む総タンパク質のサンプル 20 μg を、12% ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS) にロードしました。 -PAGE) ゲルをクーマシー ブリリアント ブルーで染色し、ポリ二フッ化ビニリデン (PVDF) 膜に転写します。 5% 無脂肪乳を含む TBS-Tween-20 (TBST) 中で 25 °C で 3 時間ブロッキングした後、メンブレンを 1:2000 に希釈したウサギ抗 H 抗体とインキュベートしました。 ロンギコルニス血清またはウサギ陰性血清をそれぞれ一晩。 次に膜をTBSTで洗浄し、1:2000に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）結合ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンG（IgG; Proteintech、米国イリノイ州シカゴ）とともに2時間インキュベートしました。 陽性シグナルは、SuperSignal® West Dura Extended Duration Substrate (Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) を使用して検出し、化学発光イメージング システム (Bio-Rad Laboratories、米国カリフォルニア州ハーキュリーズ) を通じて撮影しました。

ウサギをランダムにＰＢＳ群、Ｔｒｘ群およびｒＨＩＦＢＡ群に分けた（１群あたり６匹のウサギ）。 実験群では、０．５ｍｌのフロイント完全アジュバントと混合した０．５ｍｌのｒＨ１ＦＢＡ（１μｇ／μｌ）を０日目にウサギの背中に注射し、フロイントの不完全アジュバントと混合した同用量のｒＨ１ＦＢＡをウサギの背中に注射した。それぞれ14日目と28日目。 対照群では、アジュバントと混合した0.5mlのPBSまたはTrxタンパク質(1μg/μl)を、同じプロトコールを使用してウサギの背中に注射した。

最初の免疫化の前、および最初の免疫化から 7、14、21、28、および 35 日目に、抗体レベルの分析と光学密度 (OD) 値の決定のためにウサギの耳から血液を採取しました。 測定は同じ希釈で行われ、抗体レベルを反映しました[27]。 rH1FBA タンパク質 (1 μg/ウェル) を使用して、酵素結合免疫吸着検定法 (ELISA) プレートを 4 °C で一晩コーティングし、その後プレートをウシ血清アルブミンで 37 °C で 1 時間ブロックしました。 次にプレートを、1:200 から 1:204,800 まで連続希釈した免疫化ウサギ血清とともに 37 °C で 1 時間インキュベートし、次に HRP 結合ヤギ抗ウサギ IgG (1:10,000) とともにインキュベートしました。 37℃でそれぞれ1時間。 最後に、色基質溶液として3,3',5,5'-テトラメチルベンジジンをプレートに添加し、硫酸溶液を添加して反応を停止させた。 OD450 での吸光度は、マイクロプレートリーダー (Molecular Devices、シリコンバレー、カリフォルニア州、米国) を使用して測定しました。

ウサギ（３グループ、各グループ６匹のウサギ）の３回目の免疫化から１０日目に、４６匹の成ダニ（雌２３匹および雄２３匹）をウサギの片耳に接着された布袋に放した。 ウサギのもう一方の耳にも同様の処置を行った。 次に、雌マダニを宿主から切り離した後、刺咬マダニの数、満腹したマダニの重量、産卵および卵の孵化率を記録した。 ワクチンの有効性 (E) は 100 × [1-(EW × EO × EH)] として計算され、EW、EO、EH はそれぞれ実験群/対照群の充血したダニの体重、産卵、および卵の孵化率を表します [11 ]。

統計分析は、SPSS バージョン 17.0 ソフトウェア (IBM Corp.、米国ニューヨーク州アーモンク) を使用して実施されました。 図および表に示されているすべてのデータは、正規性がチェックされています。 同じ時点で異なるグループから収集した血液中の抗体レベルをELISAによって分析し、一元配置分散分析(ANOVA)によって実験グループと対照グループ間の差異を決定しました。 qRT-PCR 分析における HlFBA の発現と、マダニ寄生試験におけるさまざまなパラメーター (充血重量、産卵および孵化率) を、一元配置 ANOVA に続いて Tukey 検定によって分析し、さまざまな治療間の差異を確認しました。 有意水準は P < 0.05 に設定されました。

H. ロンギコルニスの H1FBA からの ORF の長さは 1092 bp (KX839690.1) で、363 アミノ酸 (aa) をコードしていました。 多重アラインメントの結果、HlFBA タンパク質 (ASV64058.1) は、Dermacentor silvarum (XP_037566647.1)、Ixodes scapularis (XP_029847818.1)、Amblyomma variegatum (DAA34561) 由来の FBA と 95%、91%、90%、および 89% の類似性を共有することが示されました。 1) とリピセファルス マイクロプラス (XP_037283106.1) 。 HlFBA タンパク質は、Araneus ventricosus (GBN85837.1)、Parastatoda tepidariorum (XP_042900530.1)、Varroa destructor (XP_022668058.1)、Trichonephila clavipes (GFY24) などの他のクモ類の FBA と比較して、77% ～ 81% の保存アミノ酸を持っていました。 485 .1）および Tropilaelaps mercedesae（OQR70008.1）（図 1）。

Haemaphysalislongicornis およびクモ類の他の種からのフルクトース-1,6-二リン酸アルドラーゼタンパク質の予測アミノ酸配列のアラインメント。 GenBank アクセッション番号: H.longicornis (ASV64058.1)、Dermacentor silvarum (XP_037566647.1)、Ixodes scapularis (XP_029847818.1)、Amblyomma variegatum (DAA34561.1)、Rhipicephilusmicroplus (XP_037283106.1)、トリコネフィラ クラビペス (GFY24485.1) )、Parastatoda tepidariorum (XP_042900530.1)、Araneus ventricosus (GBN85837.1)、Varroa destructor (XP_022668058.1)、および Tropilaelaps mercedesae (OQR70008.1)

qRT-PCRの結果は、HlFBAがさまざまな発育段階で発現され、成ダニでのその発現が他の発育段階よりも有意に高いことを示しました（F = 7.196; df = 3、8; P < 0.01;図2a）。 さらに、H1FBAは雌ダニの検出されたすべての組織で見つかり、卵巣が最も高い発現レベルを示しました（F = 218.197; df = 3、8; P < 0.01;図2b）。

さまざまな発生段階 (a) およびさまざまな臓器 (b) における HIFBA の発現パターン。 バーの上の異なる小文字は、グループ全体の有意差を表します (P < 0.05)。 円は各グループの個々の点を表します。 すべての分析は、3 つの技術的複製と 3 つの生物学的複製を使用して実行されました。 HlFBA、Haemaphysalis longicornis 由来のフルクトース-1,6-二リン酸アルドラーゼ遺伝子

ｒＨ１ＦＢＡタンパク質の分子量は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより測定したところ約６２ｋＤａであり、空のプラスミドからのＴｒｘが２２ｋＤａを占めた（図３ａ）。 rH1FBAタンパク質は、25℃で6時間誘導された上清中で高度に発現され、200 mMイミダゾール溶出条件下で十分に精製されました（図3b）。 ウェスタンブロットの結果は、rH1FBA タンパク質のみがウサギ抗 H 抗体と陽性に反応したことを示しました。 これは、ロンギコルニス血清の免疫原性特異性を示しています（図 3c）。

ドデシル硫酸ナトリウム - ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) および rHlFBA のウェスタンブロット分析。 25℃で0.5 mMイソプロピル-β-d-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）によって誘導された大腸菌BL21株の細胞におけるrH1FBAタンパク質発現のSDS-PAGE。 レーン: 1 IPTGを使用しないrH1FBAタンパク質の生成。 2、3、4、5 それぞれ、25℃、2、4、6、および8時間のIPTGによる上清中のrH1FBAタンパク質の生成。 Mマーカー; 図６、７、８、９は、それぞれ、２５℃で２、４、６および８時間のＩＰＴＧを用いた沈殿におけるｒＨ１ＦＢＡタンパク質の生成を示す。 b rH1FBAタンパク質溶出のSDS-PAGE分析。 レーン: M マーカー; 1 IPTG誘導によるrH1FBAタンパク質の生成。 2 ～ 6 個の rH1FBA タンパク質がそれぞれ 20 mM、50 mM、100 mM、200 mM、および 500 mM イミダゾールで溶出されました。 c rH1FBAタンパク質のウェスタンブロット分析。 レーン: M マーカー; 1 ウサギ抗 H とインキュベートした Ni カラムによる精製 rH1FBA。 ロンギコルニス血清。 2 ウサギ抗 H. 抗体とインキュベートした pET-32a(+)-HlFBA を含む IPTG 誘導大腸菌。 ロンギコルニス血清。 3 ウサギ陰性血清とインキュベートした Ni カラムによって精製した rH1FBA。 矢印はrH1FBAタンパク質を示します。 rH1FBA、Haemaphysalis longicornis 由来の組換えフルクトース-1,6-二リン酸アルドラーゼ

ELISAの結果は、rH1FBAで免疫したウサギの抗体レベルが、免疫時間の増加とともに徐々に増加したことを示した。 抗体レベルは 2 回目の接種後 7 日目に有意に増加し始め (F = 677.175; df = 2, 3; P < 0.01)、3 回目の接種まで高いレベルを維持しました (図 4)。 ただし、Trx グループと PBS グループの抗体レベルは有意に変化しませんでした (F = 677.175; df = 2, 3; P = 0.081)。

酵素免疫吸着法によるウサギ血清中の抗 rH1FBA (Haemaphysalislongicornis 由来の組換えフルクトース-1,6-二リン酸アルドラーゼ) 抗体レベルの検出。 矢印は予防接種日を示します。 異なる小文字は、示された時点でのグループ全体の有意差を表します (P < 0.05)。 赤い丸、青い四角、および黒い三角は、それぞれ異なる時点での HlFBA グループ、Trx グループ、および PBS グループにおける ELISA によって検出された OD 値を表します。 すべての分析は、3 つの技術的複製と 3 つの生物学的複製を使用して実行されました。

3回目の予防接種から10日目に、ニュージーランド白ウサギに成ダニを感染させました。 PBS グループ、Trx グループおよび rH1FBA グループのさまざまなパラメーターを一元配置 ANOVA によって分析しました。 マダニ寄生試験の結果は、PBS グループと Trx グループの間の充血重量、産卵および孵化率が時間の経過とともに大きく変化しないことを示唆しました (F = 5.258、P = 0.995; F = 9.331、P = 0.448; F = 80.895、P = それぞれ 0.947; df = 2、すべてで 15; 表 1)。 Trx グループと比較して、満腹ダニ重量 (F = 5.258; df = 2, 15; P < 0.05)、産卵 (F = 9.331; df = 2, 15; P < 0.01) および卵の平均 (±標準誤差) -rHlFBA グループの孵化率 (F = 80.895、df = 2、15、P < 0.01) は 142.10 ± 25.09、36.12 ± 13.68、59.65 ± 1.86% で、22.6%、45.6%、24.1% 減少しました。それぞれ。 上記パラメータに従って計算された、ｒＨ１ＦＢＡによるワクチン接種の推定免疫効率は６８．４％であった。

フルクトース-1,6-二リン酸アルドラーゼは解糖および糖新生における重要な酵素であり、生物の生命活動、エネルギー獲得および代謝活動と密接に関連しています[14]。 いくつかの研究では、通常の解糖の役割に加えて、宿主の侵入にも役割を果たしていることが示されています[28]。 本研究では、H. ロンギコルニス由来の H1FBA の分子特性評価を行い、ウサギに免疫保護を提供するその効果を推定しました。

Prompipak et al. は、Opisthorchis viverrini の FBA 遺伝子を PCR で増幅し、その全長配列が 1089 bp、362 aa をコードしていることを決定しました [15]。 リーら。 は、Clonorchis sinensis FBAのFBAを特徴付け、それぞれ362 aa、363 aa、および363 aaをコードする長さ1089、1092、および1092 bpの3つのORF (CsFBA-1、CsFBA-2、およびCsFBA-3)を報告しました[29]。 本研究では、H.longicornis 由来の H1FBA によってコードされるタンパク質のサイズは、寄生吸虫種について報告されているものと一致しました。 配列アラインメントの結果、H.longicornis 由来の H1FBA と他のダニ由来の H1FBA のアミノ酸配列の同一性は 89% 以上であるが、クモ類の他の種由来のものとは 81% 未満であり、これはそれらの進化的関係と一致していることが示されました。

ヤンら。 は、T. spiralis のすべての発生段階で旋毛虫 FBA (TsFBA) メッセンジャー RNA (mRNA) の転写を検出しました [30]。 本研究では、qRT-PCR の結果から、HlFBA 発現がダニのさまざまな発育段階で発生し、成虫で最も高いことが示されました。 これは、個人のサイズと代謝活動の違いに関連している可能性があります。 成ダニは体が大きく、代謝活動とエネルギーの必要性がより大きいため、これがこの段階で発現量が最も多くなる理由である可能性があります。 異なる組織における発現の違いは、各組織の生理機能に適しています。 卵巣におけるＨＩＦＢＡの最も高い発現は、卵形成の初期段階における活発な代謝および最も高い代謝活性に関連している可能性がある。 ただし、具体的なメカニズムについてはさらなる研究が必要です。

FBA は寄生虫の活動と生存において中心的な役割を果たしているため、潜在的なワクチン候補または治療の化学療法標的であると考えられています [30]。 Yangらによる研究では、マウスを組換えT. spiralis FBA (rTsFBA)で免疫した後、ELISAの結果から、対照群と比較してrTsFBA群のIgGレベルの有意な増加が示された。 これにより、T ヘルパー 1/T ヘルパー 2 (Th1/Th2) の混合体液性免疫応答と細胞性免疫応答が生じ、Th2 細胞が優勢となり、IgE レベルが非常に上昇しました [30]。 別の研究では、マウスをマンソン住血吸虫の組換えFBAタンパク質で免疫すると、高レベルのIgGまたはIgG1が発生しました[31]。 同様の結果が今回の研究でも起こりました。 対照群と比較して、ｒＨ１ＦＢＡ群における抗体レベルは、２回目の接種後７日目から３回目の接種までに有意に増加した（Ｐ＜０．０５）。 したがって、ｒＨ１ＦＢＡタンパク質による免疫化はウサギの体液性免疫の生成を誘導できると結論付けることができる。

他の研究でも、さまざまな寄生虫の攻撃に対する FBA の保護効果が実証されています [31、32]。 rTsFBA をワクチン接種したマウスは、成虫の負荷が 48.7% 減少し、筋肉の幼虫の負荷が 52.5% 減少しました [30]。 これらのデータは、TsFBA が T. spiralis 感染に対するワクチン開発に有効な抗原であることを示しました。 マルケスら。 マンソン住血吸虫 FBA の遺伝子を pGEX-4 T-3 プラスミドに連結し、その融合タンパク質を大腸菌で生成しました [31]。 この抗原によるマウスの免疫化は、セルカリア感染に対する有意な防御(57%)を誘導し、肝肉芽腫形成は有意に減少した[31]。 成体マンソン住血吸虫由来の FBA は、免疫マウスにおけるマンソン住血吸虫肝肉芽腫の形成も減少させます。 FBA は解糖において中心的な役割を果たし、住血吸虫のさまざまな活動と生存に必要なエネルギーの生産に重要であるため、介入の標的となっている[33、34、35]。 これらの発見は、FBA が寄生虫に対する有望なワクチン候補として使用されることを裏付けています。 我々の統計分析により、rHlFBA の免疫効率は 68.4% であることが示されました。 対照群と比較して、rHlFBA 群の満腹ダニ重量、産卵率、卵孵化率はそれぞれ 22.6%、45.6%、24.1% 有意に減少しました (P < 0.05)。 以前の研究では、宿主の血液中の抗体がリピセファルス・アペンディキュラトゥスの中腸を通過し、成体女性の体内で結合活性を保持できることが示されています[36]。 抗体がダニの H1FBA タンパク質に結合し、FBA 機能の喪失を媒介するのではないかという仮説が立てられます。 これにより、ダニは通常の方法でエネルギーを得ることができなくなります。 このエネルギーの損失は、H.longicornis ダニの満腹したダニの体重、産卵および卵の孵化率の減少として現れる可能性があります。

以前の研究では、H. ロンギコルニス (HlTIM) におけるトリオースリン酸イソメラーゼ (TIM) の免疫防御が 50.8% であることがわかりました [23]。 本研究は、ＨＩＦＢＡのワクチン効率（６８．４％）がＨＩＴＩＭのワクチン効率よりも高いことを示した。 より高い抗体力価は、マダニの侵入に対する宿主防御と相関している[37]。 この結論は、我々の研究における ELISA の結果から、H1FBA グループのより高い抗体レベルによって確認されました。 したがって、HlFBA 群の 3 つのパラメーター (充血重量、産卵、孵化率) の減少率 (22.6%、45.6%、および 24.1%) は、HlTIM 群の減少率 (8.6%、35.4%、および 17.3%) よりも高かった。 さらに、FBA 抗原と TIM 抗原の生理機能は異なり、抗体による機能損傷の程度も異なりました。 我々の結果は、FBA 遺伝子が多くのダニ種で高度に保存されており、これが広域抗ダニワクチンの開発に有益であることを示しました。 このタンパク質と他のダニ由来血清および関連する免疫実験との交差反応性を分析して、ワクチン開発の実現可能性を評価する必要があります。

rH1FBA タンパク質は、特にウサギを H. ロンギコルニス感染から保護します。 単一抗原 FBA によるワクチン接種は、ダニの生理学的反応を阻害し、正常な雌ダニの発育に影響を与え、宿主を保護する可能性があります。 グルコース代謝に関与する酵素の研究は、ダニに対する広域ワクチンの開発を促進するのに役立つ可能性がある。

この記事の結論を裏付けるデータは記事内に含まれています。

酵素結合免疫吸着アッセイ

フルクトース-1,6-二リン酸アルドラーゼ

Haemaphysalis longicornis からの FBA

ホースラディッシュペルオキシダーゼ

イソプロピル-β-d-1-チオガラクトピラノシド

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ポリ二フッ化ビニリデン

定量的リアルタイム PCR

組換えH1FBAタンパク質

TBS-トゥイーン-20

チオレドキシン

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河北師範大学生命科学部のHui Wang氏の優れた技術支援に感謝いたします。

この研究は、河北自然科学財団（C2021205010）および河北師範大学財団（L2020Z06）の支援を受けました。

Yuan-Yuan Cao と Shu-Wen Xiao も同様にこの作業に貢献しました。

教育省分子細胞生物学重点実験室、河北省動物生理学、生化学、分子生物学重点実験室、河北省生態環境協創イノベーションセンター、河北師範大学生命科学部、石家荘市、050024、中国

ユアン・ユアン・カオ、シュー・ウェン・シャオ、フォン・ヤン、シャオ・ヤ・リウ、ホイ・ルー、ヨン・ホン・フー

石家荘郵便電信技術学院、石家荘市、050021、中国

ジンチェン・チャン

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YHH は研究を計画、組織し、最終版を作成しました。 YYC と SWX が原稿を作成しました。 YYC、FY、XYL が実験とデータ解析を実施しました。 HL と JCZ はサンプルを収集し、ダニの餌やりに参加しました。 著者全員が最終原稿を読んで承認しました。

ヨンホン・フーへの通信。

この研究は、中華人民共和国の動物保護法に準拠しているものとして、河北師範大学の動物倫理委員会によって承認されました。

適用できない。

著者らは、競合する利益を持たないことを宣言します。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Cao, YY.、Xiao, SW.、Yang, F. 他 Haemaphysalislongicornis（ダニ：マダニ科）由来のフルクトース-1,6-二リン酸アルドラーゼの分子特性と免疫有効性。 寄生虫ベクター 16、169 (2023)。 https://doi.org/10.1186/s13071-023-05794-1

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受信日: 2023 年 1 月 29 日

受理日: 2023 年 5 月 2 日

公開日: 2023 年 5 月 25 日

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-023-05794-1

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