綿葉虫ヨトウヨトウ（ファブリキウス）に対するビューベリア バシアナ在来分離株の生物防除の可能性

Scientific Reports volume 13、記事番号: 8331 (2023) この記事を引用

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1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

昆虫病原性真菌 (EPF) である Beauveriaassiana は、広範囲の昆虫科に対して最も強力な生物学的防除剤として報告されています。 この研究は、バングラデシュのさまざまな土壌生息地から在来のB.assianaを分離して特徴づけ、重要な野菜害虫であるSpodoptera lituraに対するこれらの分離株の生物有効性を評価することを目的としました。 バングラデシュの土壌から分離された 7 株は、ゲノム分析を使用して B.assiana であると特徴づけられました。 分離株の中で、TGS2.3 は、処理 7 日後 (DAT) の S. litura の 2 令幼虫に対して最も高い死亡率 (82%) を示しました。 この分離株は、さまざまな段階の S. litura に対してさらにバイオアッセイされ、TGS2.3 が卵、新生児の 1 番目、2 番目、3 番目、4 番目、および 5 番目の全死亡率を 81、57、94、84、75、65、および 57% 誘導したことが判明しました。それぞれ、7 DAT を超える齢幼虫。 興味深いことに、B. bassiana 分離株 TGS2.3 で処理すると、蛹および成虫の奇形が発生し、S. litura の成虫の羽化が減少しました。 総合すると、我々の結果は、B.assiana TGS2.3の天然分離株が破壊的害虫S.lituraに対する潜在的な生物防除剤であることを示唆している。 ただし、この有望な天然分離株の植物および野外条件における生物有効性を評価するには、さらなる研究が必要です。

昆虫による作物の損失を減らすことは、世界の食糧生産にとって大きな課題となっています。 人間の健康、環境、食物連鎖への影響への懸念から、古くて安価な化学殺虫剤の多くはもはや登録されていません1。 高価で選択性の高い化学薬品や遺伝子組み換えなどの新技術が使用されていますが、この選択圧力の高まりにより、害虫の抵抗性の進化が加速しています。 世界の農業には、より環境に優しい害虫管理技術が緊急に必要とされています。

タバコ毛虫、Spodoptera litura (ファブリキウス) (鱗翅目: ヤガ科) は、カリフラワー、落花生、綿、玉ねぎ、トマト、ナス、カブ、キャベツなど 120 種類の作物にとって最も壊滅的な害虫の 1 つです2。 毎年、この病気は 5 ～ 6 世代を重ねて発生するため、迅速に処理しなければ、完全に壊滅するまでに重大な作物の損失を引き起こす可能性があります 3。 この問題を制御するために殺虫剤が最もよく使用される方法です。 これは、短期的には害虫の個体数を減らすのに効果的ですが、殺虫剤への長期曝露は、他のヤガ科のメンバーと同様に、S. litura に 3 R の問題、つまり抵抗力、昆虫の復活、作物への残留物を発症させる可能性があります4。 さらに、殺虫剤の使用は、標的以外の生物やその天敵、寄生虫、捕食者を破壊することにより、生態系の不均衡を引き起こします。 合成殺虫剤の潜在的な生態学的および健康上のリスクに対する国民の懸念が高まっているため、研究の焦点はより環境に優しい害虫防除方法に移ってきています5。

昆虫病原性真菌または昆虫病原性真菌 (EFP) (真菌: 子嚢菌門、目: Hypocreales) は、昆虫に病気を引き起こします。 これらの昆虫病原体は、害虫の管理のための生物防除剤、または「生物農薬」として使用されます6。 これらは、作物を保護し7、化学殺虫剤が環境に及ぼす有害な影響を軽減するための化学殺虫剤の代替手段を提供します8。 EPF をベースにした製品の数が増加しており、米国、英国、オーストラリア、カナダ、中国、インドなどの先進国および発展途上国で殺虫剤として登録され、使用されています8。

Hypocreales 属のメンバーの中では、Lecanicillium sp.、Beauveria sp.、Metarhizium sp. が挙げられます。 アブラムシ、鱗翅目幼虫、その他の害虫を防除するために効果的に使用されています9。 その中でも、Beauveria badsiana (Balsamo) Vuillemin は、さまざまな昆虫にホワイトマスカルディン病を引き起こす原因となっています。 ボーベリアは、機械的および化学的力を使用して宿主の表皮を分解することによって昆虫に感染します。これは、昆虫が真菌の繁殖体を直接摂取する必要がないため、害虫駆除に特に有利であり、昆虫の非摂食段階に対しても活性になります10。 さらに、さまざまな EPF によって産生される環状ヘキサデプシペプチド マイコトキシンの中で、B.assiana によって産生されるボーベリシンが最も効果的な幼虫駆除特性を示しています 11。

他のヒポクレア目と同様に、ボーベリアの種は多形性のライフステージを示します。 それらはしばしば不可解な菌類、すなわち形態学的特徴が環境に応じて変化するものとして説明されるため、形態学的記述では種レベルでの系統的構造を明らかにすることができません12。 現在、研究者らはポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) ベースの分子技術を使用して、ボーベリア種を正確に同定するためにボーベリアの系統発生を再構築しています。 分子マーカーの中でも、rDNA の内部転写スペーサー (ITS) 領域は、真菌を識別するための汎用バーコードと考えられています 13。 しかし、Hypocreales の場合、ITS 分析では多くの場合解像度が低く、Beauveria の系統を解明できませんでした 14。 ボーベリアの種レベルの決定を正しく行うには、翻訳伸長因子 1α (TEF) などの追加のゲノム マーカーが必要です 14。

B.assiana は広範囲の昆虫に対して広範な病原性を示しましたが、その生物学的有効性は分離源と標的のライフステージに依存します。 殺虫剤耐性とその再発の問題は、地域で分離された真菌で害虫を防除することで効果的に対処できます15。 これらの在来分離株は、局所的な環境条件下でも高い生存能力と持続能力を持っています16。 保全農業ガイドラインでは、輸入生物農薬による汚染を防ぐために、潜在的な天然生物因子を隔離することも重要です。 さらに、生物防除剤の病原性は、対象昆虫の異なるライフステージに応じて異なります17。 真菌接種材料に対する昆虫のより疑わしい段階を特定することにより、野外条件における生物学的防除戦略の生物有効性が高まります。 したがって、本研究は、天然のボーベリア分離株を単離および分子的に特徴付け、S. litura のさまざまなライフステージに対するそれらの生物有効性をテストするために実施されました。

選択培地で分離された真菌分離株のうち、7 つの分離株がビューアベリア種の形態の特徴を示しました。 分離株の単一の真菌コロニーは、色が白く、丸く、粉のような外観でわずかに盛り上がっており、円形のリングを備えた軽い綿毛状でした。 分生子は硝子質で円形であった。 単細胞の分生子柄は短く、密に集合し、硝子質でした（図 1）。

代表的なボーベリア分離株 TGS2.3 の形態学的特徴。 (a) 15 日後の培養、(b) 分生子を持つ分生子柄。

ITS および TEF の部分配列データセットは、Geneious V.11 ソフトウェアによって個別に処理および分析され、アクセッション番号は NCBI から取得されました (表 1)。 7 つの分離された Beauveria 分離株のゲノム ITS および TEF データは BLAST 類似性を示し、NCBI データベースの BLAST 検索結果には B. badsiana への多くの言及がありました。 ITS データセットの再構成された最尤系統樹は、形態学的に特徴的な 7 つの分離株が、中程度のブートストラップ サポート値 (60%) を持つ参照 B.assiana 分離株とクラスター化されていることを示しました (図 2)。 さらに、TEF データセットで構築されたツリーは、分離された Beauveria 分離株と B.assiana への参照を含むクレードの最大のサポート (100%) を示しました (図 3)。 したがって、ITS データセットと TEF データセットの両方で、分離された菌株が B.assiana であることが確認されました。

GTR-GAMMA モデルにおける 1000 回のブートストラップ複製の ITS データセットの最尤系統樹。

GTR-GAMMA モデルでの 1000 個のブートストラップ複製の TEF データセットの最尤系統樹。

全体の平均菌糸体の成長により、真菌分離株 TGS2.3 (388.27 ± 10.29 mg/100 mL) が最も高いバイオマス生産を示し、TGS1.2 (208.8 ± 8.03 mg/100 mL) で最も低い成長が観察されたことが明らかになりました (図 4) ）。

SDA液体ブロス中でのB.バッシアナ分離株のバイオマス生産。 異なるアルファベット文字の値 (平均 ± SE) は、統計的に有意な差を示します (lsd、p < 0.05)。

7 つの B.バッシアナ分離株による 2 齢幼虫の感染から 7 日後、TGS2.3 の死亡率が最も高く (81.72 ± 2.15%)、次いで TGS2.1 (72.40 ± 3.46%)、BeauD1 (61.29 ± 1.08%) であることが明らかになりました。 、BeauA1 (51.61 ± 2.15%)、KSS1.1 (49.46 ± 4.69%)、TGS1.2 (46.59 ± 2.71%)、および KSS2.2 (43.73 ± 3.78%) (図 5)。

ボーベリア分離株で処理した S. litura の 2 齢幼虫の死亡率。 異なるアルファベット文字の値 (平均 ± SE) は、統計的に有意な差を示します (lsd、p < 0.05)。

この発見は、TGS2.3 および TGS2.1 で処理した S. litura の 2 齢幼虫の死亡は、主に感染の最初の 2 日間に、特に TGS2.3 の場合は 1 日目に発生したことを示唆しています。 死亡率は、他のボーベリア分離株によって、1 日目から 7 日目までより徐々に引き起こされました。 BeauA1、BeauD1、KSS1.1、KSS1.2、KSS2.2、TGS1.2（図6）。

B.assiana分離株で処理したS.lituraの7日間の累積死亡率。

初日が最も多くの死亡が発生した日であるため、結果を統計的に分析して、どの分離株が最も高い初日死亡率を誘発したのか（感染後 24 時間以内に高い死亡率を引き起こした）を確認しました。 TGS2.3 (56.67 ± 7.02%) に感染したサンプルの 1 日目死亡率が最も高く、TGS2.1 (43.33 ± 3.51%) がそれに続きました (図 7)。

B.assiana分離株で処理したS.lituraの2齢幼虫の1日目死亡率。 異なるアルファベット文字の値 (平均 ± SE) は、統計的に有意な差を示します (lsd、p < 0.05)。

TGS2.3 処理卵では、対照と比較して卵の孵化率が大幅に低下しました。 分離株TGS2.3は81.25±2.75%の卵死亡率を誘導したが、対照では18.5±2.65%であった(図8)。 処理７日後のデータは、ＴＧＳ２．３が５７．２５±６．３４％の新生児幼虫死亡率を誘発したのに対し、対照では８．２５±２．６３％であったことも明らかにした（図９）。

B. bassiana 分離株 TGS2.3 に感染した S. litura 卵の死亡率。 異なるアルファベット文字の値 (平均 ± SE) は、統計的に有意な差を示します (lsd、p < 0.05)。

卵期に TGS2.3 で処理した新生期幼虫の死亡率。 異なるアルファベット文字の値 (平均 ± SE) は、統計的に有意な差を示します (lsd、p < 0.05)。

TGS2.3 分離株で処理された幼虫は真菌感染症で死亡し、さまざまな幼虫段階で異なる死亡率を示しました。 最も高い死亡率は 1 齢幼虫 (94.45 ± 4.60%) で記録され、最も低い死亡率は 5 齢幼虫 (56.56 ± 2.07%) でした。 3 齢幼虫と 4 齢幼虫の死亡率は統計的に類似していました (図 10)。

B. bassiana 分離株 TGS2.3 で処理した S. litura のさまざまな幼虫段階の死亡率。 異なるアルファベット文字の値 (平均 ± SE) は、統計的に有意な差を示します (lsd、p < 0.05)。

7 日間にわたる累積死亡率は、1 齢幼虫の 1 日目の死亡率が最も高く、4 日目まで徐々に上昇したことを示しています。 2齢幼虫の死亡は1日目に始まり、その後5日目まで増加しました。 3齢幼虫は3日目まで死亡せず、死亡率は6日目まで進行した。 4 齢と 5 齢の幼虫の死亡は 4 日目に発生し、その後 7 日目まで増加しました (図 11)。 全体として、さまざまな時点にわたる死亡率から、S. litura のすべての幼虫が真菌 TGS2.3 に感受性であることが明らかになりました。

B.assiana分離株TGS2.3で処理したS.lituraの異なる齢幼虫の累積死亡率。

感染した幼虫の運動性は低下しました。 幼虫は死んだ後、硬くなっていました。 死後 2 日以内に、死亡した幼虫は菌糸体を生成し始めました。 (図12)。 B.バッシアナの感染は、この真菌の増殖から調製されたスライドによって確認されました。 対照幼虫と比較した場合、B.assiana は 2 齢、3 齢、4 齢、および 5 齢の成虫の羽化に悪影響を及ぼしました。 真菌処理幼虫から出現した成虫の数は、対照幼虫 (94%) よりも少数でした (7.11 ～ 37.94%) (図 13)。

B.assiana 分離株 TGS2.3 により真菌化された S. litura の幼虫の死体。

B. bassiana 分離株 TGS2.3 による処理による S. litura 幼虫の成虫の羽化。 異なるアルファベット文字の値 (平均 ± SE) は、統計的に有意な差を示します (lsd、p < 0.05)。

真菌感染はさまざまな異常を引き起こしました。 処理された幼虫の一部が蛹に脱皮したとき、それらは脱皮膜から完全には分離しませんでした（図14）。 一部の蛹には完全に発達した表皮が欠けていました。 2 齢幼虫を B.assiana で処理した場合、9.33 ± 2.08 パーセントの蛹奇形が認められました。 同様に、蛹の変形は、3、4、5齢幼虫の処理により、それぞれ7.67±1.53、10±2、および6.67±1.53パーセントでした（図15）。 真菌に感染した幼虫から発生した成虫は、3.67 ～ 10% の奇形を有し (図 16)、折りたたまれた未発達の翅 (図 17) を持っていました。 しかし、対照群には変形は見られませんでした。

脱皮殻から切り離されていない成体。

B.assiana分離株TGS2.3による処理によるS.litura幼虫の蛹変形。 値間で統計的に有意な差は観察されませんでした (平均 ± SE) (lsd、p < 0.05)。

B.assiana分離株TGS2.3による処理によるS.litura幼虫の成体変形。 異なるアルファベット文字の値 (平均 ± SE) は、統計的に有意な差を示します (lsd、p < 0.05)。

(a) 正常な蛹、(b) 変形した蛹、(c) 正常な成虫、(d) 変形した成虫。

タバコ毛虫 (S. litura) は、さまざまな作物にとって最も壊滅的な害虫の 1 つです。 殺虫剤は、この問題を制御するために最も一般的に使用される方法です。 殺虫剤の使用は、標的以外の生物とその天敵、寄生虫、捕食者を破壊することにより、生態系の不均衡を引き起こします。 合成殺虫剤の潜在的な生態学的および健康上のリスクに対する国民の懸念が高まっているため、研究の焦点はより環境に優しい方法に移ってきています。 このうち B.assiana は、広範囲の昆虫にホワイトマスカルディン病を引き起こします。 殺虫剤耐性とその再発の問題は、地域で分離された真菌で害虫を防除し、より疑わしい段階の昆虫を標的にすることで効果的に対処できます。

この研究では、7 つの B.assiana 分離株が土壌サンプルから分離され、バングラデシュで初めて地域分離株として報告されました。 以前の研究 5,18 で記載された形態は、我々の 7 つの分離株の形態と類似していました。 ITS 系統学では、これら 7 つの分離株に対して中程度の支持値が得られ、これまでに報告されていた ITS 解析が不適切であることが確認されました 1,14,19。 しかし、ITS は、PCR 増幅効率 20,21,22 と参照データの入手可能性 23 により、広範囲の野外分離株の迅速なスクリーニングに使用できます。 TEFデータを用いたさらなる分子分析により、B.assianaクレードにおける7つの分離株の系統学的位置が非常に強力に裏付けられ、Hypocreales菌の系統解明におけるその有効性が証明されました1,14,19。

最良の昆虫病原性 B. バシアナ分離株を見つけるために、2 齢幼虫の全体的および毎日の死亡率を調査し、各真菌分離株によって誘発される死亡率を決定しました。 最も高い死亡率は B.assiana 分離株 TGS2.3 によって引き起こされ、これは分生子の付着、発芽率、成長条件、酵素や二次代謝産物の生成などのより高い昆虫の病原性によるものである可能性があります。 真菌感染のまさに最初の段階は分生子の付着であり、分生子の付着の強さは昆虫病原性真菌の毒性の重要な指標です。 真菌細胞のクチクラへの付着には、特異的な受容体リガンドおよび/または非特異的な疎水性および静電機構が関与している可能性があります 24、25、26。 EPF の接着力が弱まると、宿主から分生子が洗い流され、感染が防止される可能性があります 27。 B.バッシアナの異なる分離株間の病原性の変動は、それらの疎水性の性質または生化学のレベルの違いによるものである可能性があります。

二次代謝産物の合成により、EPF が昆虫の免疫学的防御をすり抜けて真菌症を促進する可能性があります 6。 いくつかの研究によると、EPF B.assiana は宿主特異的な二次代謝産物を生成し、少量では 50% の死亡率をもたらす可能性があります 11,28。 最も高い昆虫死亡率を示した菌株 TGS2.3 は、S. liturta に対して殺虫活性を持つ生物学的に活性な化合物を生産する可能性があります。 B.assiana 分離株 TGS2.3 によって生成される生理活性化合物を特定するには、さらなる調査が必要です。 これらの化合物の研究と生産は、侵入作物害虫を防除するための新たな可能性を開く可能性があります。

分生子の発芽や加水分解酵素の生成などのパラメーターは、EPF21、29、30、31 の毒性と関連しています。 B.assiana では発芽速度が速いほど毒性が高いことが判明しました 29。 TGS2.3 の初日死亡率はすべての分離株の中で最も高く、TGS2.3 の発芽率が高いことが示唆されました。 プロテアーゼ、キチナーゼ、リパーゼなどの加水分解酵素が EPF によって分泌され、宿主種の表皮を分解して感染します 32。 より高い酵素活性は、TGS2.3 のより高い毒性の理由の 1 つである可能性があります。 高性能の Beauveria 候補である TGS2.3 についてこれらの仮説を検証するには、さらなる調査が必要です。

卵が動かないことが、昆虫が微生物感染に対して脆弱になる主な理由です33。 卵が孵化して孵化するまでに必要な栄養素は過剰であり、この段階では病原性微生物の標的にされやすい34。 この研究は、S. litura の卵が TGS2.3 に対して非常に感受性であることを示しました。 同様の結果は、B.assiana が S.frugiperda 35,36 および Phthorimaea operculella 37 で卵死亡率を誘発した以前の研究でも見られました。 分離株 TGS2.3 も新生幼虫の死亡を誘導しましたが、これは Idrees らによって行われた別の研究と同様です 17。

幼虫の死亡率は1齢が最も高く、段階が進むにつれて徐々に減少した。 1 齢幼虫は 5 齢幼虫よりも 38% 高い死亡率を経験しました。 これは、幼虫の感受性が年齢とともに低下することを示しています。 Shweta と Simon38 は S. litura Fab に対して B. badsiana を使用しました。 (タバコキャタピラー) では、1 齢および 2 齢の幼虫が後期よりも高い死亡率を示しました。 さまざまな齢期間の死亡率のこうした変動は、酵素活性に起因する可能性があります。 さまざまな研究によると、解毒酵素の活性は発達段階全体および発達段階内で大きく変化します。 この活性は卵の段階では控えめで、幼虫または若虫の齢が上がるごとに増加し、蛹化中に最終的にはゼロに減少します 39,40。

EPF 分離株 TGS2.3 は、S. litura のライフステージ全体にわたって亜致死性を示しました。 蛹および成虫の奇形は、幼虫期の真菌感染の結果として生じました。 幼虫は蛹に適切に移行できませんでした。 昆虫の脱皮は B.assiana によって妨げられていると報告されています 41。 脱皮プロセス中の新しいクチクラの発達は栄養素に大きく依存するため、真菌感染症によって血リンパの栄養バランスが崩れると、プロセスのどの段階でも影響を受ける可能性があります。 B.assiana 分離株 TGS2.3 のこの亜致死性は、この真菌が S.litura に及ぼす亜致死的影響が比較的長期にわたり、直接的な死亡率に加えて S.litura 個体数をより効果的に減少させる可能性があることを示唆しています。

要約すると、この研究では、最も強力な分離株である TGS2.3 が卵の孵化と S. litura の毛虫のすべての段階に対して効果的であることがわかり、この真菌分離株をこの標的の孵化段階と摂食段階の両方を標的とするために利用できることが示唆されました。昆虫。 加えて、S. litura の幼虫発生の初期段階では真菌感染症の影響を受けやすくなっています。 亜致死効果はまた、昆虫病原体に一度曝露されると、B.バッシアナ分離株TGS2.3が、昆虫の子孫の生活段階のいずれにおいても昆虫を殺し、成虫の羽化を抑制する能力を有することを実証した。 この研究は、天然のB.バッシアナ分離株の生物学的有効性を正確に評価するために、実験室条件と野外条件の両方で植物の評価をさらに行うことを保証します。 しかし、この研究の結果は、合成殺虫剤の使用を制限するだけでなく、代替の S. litura 害虫駆除技術を開発し、それによって生態系への悪影響を最小限に抑える可能性をもたらしました。

土壌サンプルは、バングラデシュのガジプールにあるバワル サル森林と農地から採取されました。 複合サンプルを作成するために、合計 250 ～ 300 g の 5 つの異なる土壌サンプルを、土壌サンプラーを使用して 10 ～ 15 cm の深さから混合しました。 すべての調査が完了するまで、土壌サンプルはラベル付きの個別のジップロック袋に入れて冷蔵室で 4 °C に維持されました。

5 グラムの土壌と 50 mL の 0.1% Tween 80 を含む土壌懸濁液をねじ蓋付きプラスチックチューブで作成し、5 mm のふるいにかけた後、室温で 3 時間インキュベートしました。 各チューブの５回の反転を３０分間隔で実施した。 インキュベーション後、チューブを沈降させるために 20 秒間保持し、各チューブからの上清 100 μL をサブローブドウ糖寒天 (SDA) 培地 (ペプトン 10 g/L、寒天 10 g/L、ブドウ糖) を含むペトリ皿にプレーティングしました。 40 g/L、CTAB 60 mg/L）。 細菌汚染を避けるために、ストレプトマイシン (30 mg/L) も追加されました。 接種後、すべてのプレートを 22 °C で 2 週間のインキュベーション期間にかけました。 2 ～ 3 日ごとに、プレートに認識可能な厚く緻密な白い菌糸体が発達しているかどうかをチェックしました。 Hypocreales 様分離株を分離し、継代培養しました。

SDA 上の真菌コロニーの栄養構造と生殖構造の両方を、胞子形成直後に顕微鏡を使用して検査しました。 真菌コロニーの最も外側の部分から、小さなプラークをスライドガラスに移し、複合光学顕微鏡で検査した。

抗生物質を含まない SDA 寒天プレート上で、DNA の単離と配列決定のために分離された真菌を継代培養しました。 Islam1 によって記載された手順を使用して DNA を抽出しました。

簡単に説明すると、7 日間培養した真菌菌糸体の小さな塊をエッペンドルフ チューブに入れ、滅菌プラスチック乳棒で潰し、1 mL の溶解バッファー (400 mM Tris-HCl、pH 8.0、60) に懸濁しました。 mM EDTA、150 mM NaCl、および 1% SDS）を使用し、ヒートブロック内で 50 °C で 1 時間インキュベートしました。 150μLの沈殿緩衝液(5M酢酸カリウム、60.0mL、氷酢酸、11.5mL、蒸留水、28.5mL)をチューブに加え、短時間ボルテックスし、次いで氷上で5分間インキュベートした。 遠心分離からの上清を500 mLのイソプロパノールとともに新しいチューブに移し、DNAを沈殿させた。 18,000 rcfで20分間遠心分離した後、DNAペレットを回収し、1 mLの70%エタノールで洗浄した。 10 分間風乾した後、DNA ペレットを 100 μL の Tris-EDTA (TE) バッファーに溶解しました。 ナノドロップでは、DNA の純度が検査されました。 ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) を使用して、プライマー ITS1F: CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA および ITS4R: TCCTCCGCTTATTGATATGC をプロファイルに従って使用して ITS 領域を増幅しました: 90 °C で 2 分間の変性、その後 95 °C で 30 秒間の変性を 35 サイクル、55 °C で 30 秒間のアニーリング、72 °C で 1 分間の伸長、そして最後に 72 °C で 15 分間の伸長。 プロファイルが 94 °C で 5 分間の初期変性を受け、続いて 94 °C で 40 秒間 35 サイクルを受けた後、EF1TF (5'-ATGGGTAAGGARGACAAGAC) および EF2TR (5'-GGAAGTACCAGTGATCATGTT) を使用して 5'-TEF 領域を増幅しました。 、65 °C で 40 秒、72 °C で 2 分間、そして最終伸長は 72 °C で 10 分間です19。 PCR産物は、GelRed核酸染色剤を用いて1×TBE緩衝液中の1%アガロース中で120Vで電気泳動され、UV光下で分子イメージャーで写真撮影されました。 配列決定のために、PCR 産物は韓国の Macrogen に送られました。

真菌分離株のサンガー配列データが作成され、国立バイオテクノロジー情報センター (NCBI) データベースでの BLAST 検索が完了しました。 ITS と TEF の部分配列データセットは、アクセッション番号を取得するために NCBI に提出されました。 この配列は、NCBI から入手した参照ゲノム配列と一致しました。 Geneious V.11 の MAFT プラグインは複数の位置合わせに使用され、最終的な位置合わせは手動で修正されました。 系統樹は、Geneious V.11 RAxML プラグインを使用したデータセットの最尤法分析によって開発されました。高速ブートストラップを使用し、GTR-GAMMA モデルの 1000 のブートストラップ複製から最高スコアの ML ツリーを検索しました。

S. litura の卵は、バングラデシュのガジプールにあるバングラデシュ農業研究所 (BARI) 昆虫学部門の既存の培養物から入手されました。 同じ日に孵化した卵から均質な幼虫を得た。 幼虫は、0.5% (v/v) 次亜塩素酸ナトリウムで 10 分間消毒したオクラ片を入れた滅菌プラスチック箱中で、25 ± 2 °C および 65 ± 5% RH42 に維持して生育させました。

この研究ではサブローブドウ糖寒天 (SDA) 培地を使用しました。 10 mm の活発に増殖した B.assiana 培養物を、10 mL の固体 SDA 培地を含む 60 mm ペトリ皿の中心に個別に配置しました 43。 接種したプレートを 28 °C で 7 日間インキュベートしました。 次に、10 mL の滅菌 Tween 80 (0.05%) を皿に注ぐことによって分離株の分生子懸濁液を調製し、寒天表面を滅菌ガラス棒で静かにこすり、懸濁液を滅菌 250 mL ビーカーに集めました。 この懸濁液を 50 mL に調整し、ハンドミキサーで混合して分生子を分離・分散させ、最終的に血球計算盤 44 を用いて分生子密度が 1 ml あたり 1.5 × 108 個の分生子となるように調整しました。 バイオアッセイ実験の前に、分生子発芽を SDA 寒天培地上で試験しました。

250 mL のサブロー デキストロース ブロス (SDB) を 500 mL ショット ボトルで調製し、最終 pH を 6.5 に調整しました。 次いで、液体ブロスに真菌の１０ｍｍ培養ディスクを接種した。 すべての B.assiana 分離株について 3 つの複製が維持されました。 セットアップ全体を、温度 25 °C、120 rpm のシェーカー インキュベーター内で 10 日間保持しました。 ７日後には白い綿球状の増殖が観察された。 次に、菌糸体を予め秤量した濾紙を通して濾過し、一定の重量が得られるまで70℃の熱風オーブンで乾燥させた。 これにより、すべての真菌分離株のバイオマス生産能力が明らかになりました 43。

生後 1 ～ 2 日の産みたての卵塊を収集し、解剖顕微鏡で数を数えました。 ヘアブラシを使用して 50 個の卵のバッチを分離し、ペトリ皿に移しました。 0.05% Tween 80 を使用して、10 mL の分生子懸濁液 (1.5 × 108 個の分生子/mL) を作成しました。次に、懸濁液を卵塊上に噴霧しました。 対照には、Tween 80 のみを使用しました。 各処理を 4 回繰り返しました。 処理の７日後（ＤＡＴ）、孵化した卵と孵化していない卵の数を数えた。 次に、新たに孵化した幼虫に餌を与え、25 ± 2 °C で培養し、次の 7 日間監視しました。 各治療の死亡率は注意深く記録されました17。

産まれたばかりの卵を収集し、孵化させて均質な幼虫を得た。 アッセイは、S. litura の 2 齢幼虫に対して実施されました。 3 連の 10 匹の幼虫のセットを、ボーベリア分離株の分生子懸濁液 10 mL (1.5 × 108 分生子/mL) に個別に 5 秒間浸漬しました。 処理後、幼虫の各セットを別の滅菌プラスチック箱に移しました。 各箱に、飼料として湿らせたあぶらとり紙と消毒したオクラを加えました。 一日おきに紙と給餌を交換しました。 7 DAT で、幼虫の死亡率が分離株に従って記録されました 42。

真菌処理を経て生き残った幼虫を、25 ± 2 °C、相対湿度 60 ～ 70% で蛹になるまでさらに飼育し、対照と比較した発育の変化、あらゆる種類の変形、寿命などの亜致死活性を調べました。 幼虫と蛹の変形、成虫の羽化、およびさまざまな発達段階における形態的変形について観察が行われました 3。

死亡率はアボットの公式によって補正されました45。 パーセント データはアークサイン変換によって変換されました。 データは分散分析 (ANOVA) に供され、その後、最小有意差 (LSD) を使用してさまざまな治療の平均が比較されました。 分析は R バージョン 3.4.2 を使用して実行されました。

現在の研究中の真菌分離株の ITS および TEF ゲノム領域の部分配列データは、それぞれアクセッション番号 OP784778 ～ OP784784 および OP785280 ～ OP785286 で NCBI リポジトリで入手可能です (2022 年 12 月 4 日に入手可能になります)。 現在の研究中に使用および/または分析された統計データセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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この研究は、BAS-USDA 寄付プログラム (第 4 期 BAS-USDA BSMRAU CR-13) に基づいてバングラデシュ科学アカデミーから資金提供を受けました。 著者らはまた、バングラデシュのガジプールにあるバングラデシュ農業研究所（BARI）の昆虫学部門が、採卵と飼育を支援してくれたことに感謝の意を表した。

バイオテクノロジーおよび遺伝子工学研究所、バンガバンドゥ・シェイク・ムジブル・ラーマン農業大学、ガジプール、バングラデシュ

シャー・モハマド・ナイムル・イスラム、メリーランド州ザヒド・ハサン・チョードリー、マジャビン・フェルダウス・ミム、トファザル・イスラム

バングラデシュ、ガジプールの綿花研究訓練および種子増殖農場

ミリア・ベンテ・モムタズ

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SMNI はアイデアを概念化し、実験を監督し、原稿を執筆、編集しました。 MZHC は実験を計画し、データを分析し、原稿を書きました。 MFM は真菌および分子の研究を実施し、MBM は昆虫の生物検定を実施し、TI は解釈に貢献し、原稿のレビューと編集を行いました。 通信および資料のリクエストは SMNI または TI に宛ててください。

シャー・モハマド・ナイムル・イスラムまたはトファザル・イスラムへの対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

イスラム、SMN、チョードリー、MZH、ミム、MF 他綿葉虫ヨトウヨトウ（ファブリキウス）に対するビューベリア バシアナの天然分離株の生物防除の可能性。 Sci Rep 13、8331 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-35415-x

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受信日: 2022 年 11 月 29 日

受理日: 2023 年 5 月 17 日

公開日: 2023 年 5 月 23 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35415-x

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